论文部分内容阅读
灵芝三萜类化合物是灵芝的重要药用成分,具有多种重要的生理功能,灵芝中三萜含量的高低已经成为灵芝质量高低的重要指标。灵芝羟甲基戊二酰辅酶A合酶基因(GlHMGS)作为甲羟戊酸途径中的第一个催化酶,催化乙酰CoA与乙酰乙酰CoA生成羟甲基戊二酰CoA,对于灵芝三萜的合成起着十分重要的作用。根据已发表的其它物种HMGS氨基酸序列的保守区,设计简并引物,以灵芝基因组DNA和反转录的原基cDNA为模板,经PCR扩增,获得了两个大小分别为600、350bp的灵芝羟甲基戊二酰辅酶A合酶基因特异的DNA和cDNA片段。利用获得的GIHMGS基因特异片段,根据SEFA-PCR的原理,设计特异性引物,以灵芝基因组DNA为模板扩增得到GIHMGS基因的5′端序列；以灵芝原基cDNA作为模板,通过3’RACE技术获得GIHMGS基因的3′端cDNA序列；进而根据获得的5′端和3′端序列信息设计引物,分别以灵芝总基因组DNA和原基cDNA为模板,得到GIHMGS基因的全长DNA和cDNA序列。结果表明：该基因DNA全长为1870 bp,其中ORF为1413 bp,编码471个氨基酸,推测的分子量为51.14 kDa。通过比对获得的DNA和cDNA序列,发现GlHMGS由5个外显子和4个内含子构成；与NCBI数据库中HMGS的蛋白序列比对发现,GIHMGS与解脂耶罗威亚酵母的HMGS表现出最高的同源性(51%)。进化树分析也表明GIHMGS与真菌亲缘关系最近,符合灵芝的物种分类地位。将获得的GIHMGS基因转入HMGS缺陷的二倍体酿酒酵母菌株YSC1021,经产孢培养和单倍体筛选获得HMGS缺陷的单倍体转化子,发现在有GIHMGS表达的单倍体酵母转化子中,其HMGS缺陷的表型可以得到互补,从而证实了所得GIHMGS的功能。另外,根据GIHMGS基因DNA序列设计引物,以灵芝基因组DNA为模板,利用SEFA-PCR技术扩增GIHMGS基因上游启动子序列,该序列长约1561 bp,用Softberry等软件对启动子序列进行分析,发现GIHMGS基因启动子中包含有明显的TATA-box和CAAT-box,并发现了多个与甾醇、激素和环境压力等调节相关的顺式作用元件。同时,利用Real Time RT-PCR技术,检测了灵芝不同发育阶段中GlHMGS在mRNA水平的表达差异。结果证明,GlHMGS mRNA的转录水平以灵芝发育初期的菌丝体阶段最高,而在三萜含量最高的原基时期很低,说明GlHMGS可能同时受到了发育调节和甾醇的反馈抑制。对茉莉酸甲酯诱导条件下GlHMGS mRNA转录水平的检测也发现：茉莉酸甲酯对GlHMGS的影响十分明显。其中以茉莉酸甲酯作用浓度为100μM处理5天时对GlHMGS的诱导效果最显著；同时,对GlHMGS启动子的分析发现其上存在潜在的茉莉酸甲酯响应元件。这些结果表明,GlHMGS可能同时受多种生理途径的综合调节,并在灵芝三萜生物合成途径中起着重要的作用。本实验还研究了灵芝漆酶的同工酶基因Laccase受金属Cu2+诱导表达的转录特性,并通过对其5′端转录调控区的克隆和结构分析,初步探讨了其结构与漆酶基因转录表达的内在关系；进而在此基础上构建了一个Cu2+诱导型表达载体系统；以期通过诱导型超量表达分析,进一步揭示GlHMGS在灵芝三萜类化合物途径中的作用。