胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,特别多见于亚洲国家如中国,日本和韩国。多数病人在诊断时已属晚期,联合化疗的预后很差。目前尚无进展期胃癌的确切有效治疗方案。近年来,生物制剂如单克隆抗体与化疗药物的联合在乳腺癌,结肠癌和肺癌的治疗中取得显著的疗效。这些结果证实了生物制剂与化疗药物联用比单独化疗有效,且进一步提示其它生物制剂如细胞因子等与化学制剂的联合也可能有更好的疗效。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor necrosis factor(TNF)-relatedapoptosis-inducing ligand,TRAIL)是TNF超家族的成员之一,可与死亡受体结合诱导细胞凋亡。和TNF家族的其它成员不同,TRAIL可诱导多种肿瘤细胞的凋亡,而对正常细胞毒性很轻。更为重要的是,TRAIL诱导的炎症反应比其它TNF成员轻。TRAIL对肿瘤细胞的选择性毒性和仅诱导低水平炎症反应使得它有可能成为有效的特异性抗肿瘤药物。应用TRAIL受体激动型抗体的临床实验研究在一些实体肿瘤中已取得一定疗效。虽然TRAIL对大多数肿瘤有很好的活性,但研究也发现一些肿瘤细胞对TRAIL诱导的凋亡存在天然或获得性耐药。全面了解TRAIL耐药机理是克服耐药,将TRAIL应用于临床治疗的前提。有报告TRAIL与受体结合可激活NF-κB(nuclear factorkappa-B),继而启动抗凋亡基因的转录,阻止细胞发生凋亡。抑制NF-κB活性可增加一些肿瘤细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性。但是在有些时候,NF-κB失活不能增强TRAIL诱导的凋亡。这些矛盾的结果提示NF-κB活化不能保护所有细胞逃避TRAIL诱导的凋亡。NF-κB在不同肿瘤细胞中对TRAIL诱导凋亡的影响需要进一步研究。除NF-κB外,其它信号传导通路也参与TRAIL耐药。Phosphatidylinositol3-kinase(PI3K)/Akt是重要的信号通路,可调控细胞生存,增殖及凋亡。它可被多种刺激激活,通常发挥抗凋亡作用。有报告PI3K/Akt信号通路与TRAIL耐药有关。使用特异性抑制剂或小RNA干扰阻断PI3K/Akt通路可逆转一些细胞对TRAIL的原发耐药。关于增强TRAIL敏感性的研究已在多种肿瘤细胞中进行,如肺癌和结肠癌等。近年来的研究显示一些化学制剂可增强胃癌细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性,但是目前为止这些制剂都不能用于临床治疗。硼替佐米是一种新发现的蛋白酶体抑制剂,已经被美国食品与药品管理局(U.S.Food and Drug Administration,FDA)批准用于多发性骨髓瘤和套细胞淋巴瘤的治疗。硼替佐米的主要抗肿瘤功能是阻止NF-κB的抑制体IκB在蛋白酶体中降解,从而阻断NF-κB活化。有报告硼替佐米可与TRAIL协同,增强TRAIL对一些原发耐药细胞诱导的凋亡,如非小细胞肺癌,卵巢癌和胰腺癌。这些结果鼓励我们将硼替佐米与TRAIL联合用于胃癌的治疗。本研究以三种胃癌细胞系为模型,研究硼替佐米对TRAIL诱导细胞凋亡的影响,包括caspase裂解,线粒体膜电位的变化和对凋亡相关蛋白的影响,以及NF-κB和PI3K/Akt通路在TRAIL诱导凋亡中的作用。材料与方法1.采用MTT方法测定细胞活力,绘制生存曲线。2.采用流式细胞术PI染色进行细胞凋亡及细胞周期检测3.采用流式细胞术DiOC6染色测定线粒体膜电位变化。4.采用Western blot法检测蛋白的表达。5.采用Lipofectamine 2000试剂进行瞬时转染。6.统计学分析:数据以均数±S表示。两组间差异采用Student’s t test分析。P＜O.05认为有统计学意义。实验结果一、硼替佐米增强胃癌细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性1.50 ng/mL的TRAIL作用于三种细胞24 h后,细胞存活率分别为72.67±4.93%,92.33±5.86%,和98.33±2.31%。延长TRAIL作用时间到48 h,或提高TRAIL浓度至1000 ng/mL,均不能进一步增强TRAIL的毒性。流式细胞术PI染色结果提示TRAIL作用24 h后,三种细胞系中亚二倍体比率不足8%。2.50 nM硼替佐米单独作用胃癌细胞仅引起轻度细胞死亡。50 nM硼替佐米预处理可增强TRAIL对三种胃癌细胞的毒性。在MGC803细胞,联合用药可将细胞活力从70.424±1.14%减低到34.854±2.83%,细胞凋亡从8.22±0.83%增强到31.274±2.02%。类似的协同作用也见于另两种细胞系。3.50 nM硼替佐米和50 ng/mLTRAIL单独作用于三种胃癌细胞系,24 h后均可见到线粒体跨膜电位的下降。硼替佐米预处理2 h后再予TRAIL作用24 h,线粒体跨膜电位被进一步降低。在MGC803细胞,TRAIL单独作用24 h可使线粒体跨膜电位下降10.974±4.66%,硼替佐米联合TRAIL可使线粒体膜电位下降54.274±7.71%,与TRAIL单药相比有统计学意义,P＜0.05。在SGC7901,BGC823细胞中,硼替佐米预处理也可进一步增强TRAIL引起的线粒体跨膜电位下降,但是与TRAIL单药相比无统计学差异。4.50 nM硼替佐米预处理三种细胞系2 h后,加入50 ng/mL TRAIL继续作用12 h,三种细胞系中G2/M期细胞比率明显增加。与TRAIL联用并未进一步增加G2/M期阻滞。5.TRAIL或硼替佐米单独作用于SGC7901细胞24 h均不能诱导caspase 8活性片段的产生,但二者联用可明显裂解caspase 8,继而裂解caspase 3,同时Caspase 3及caspase 8前体明显减少。相似的caspase变化也见于其它两种胃癌细胞系。硼替佐米联合TRAIL对死亡受体DR5,凋亡相关蛋白Bcl-2,Bax的表达无明显影响,但是可轻度下调cIAP-1的表达。硼替佐米单药可明显上调Survivin表达,与TRAIL联用并未进一步增加表达上调。二、TRAIL活化NF-κB通路阻止胃癌细胞凋亡1.50 ng/mL TRAIL处理SGC7901细胞30 min后可活化NF-κB,Western blot可检测到清晰的IκB降解。而TNF可于更早时间激活NF-κB,在处理后15 min即可检测到IκB降解,且其降解程度明显强于TRAIL诱导的IκB降解。2.用空载体或编码磷酸化缺陷突变型HA标记IκB(HA-IκB)的cDNA瞬时转染SGC7901细胞48 h,加入50 ng/mL TRAIL继续作用24 h,转染空载体的细胞仅7.09±0.84%发生凋亡,而转染突变型HA-IκB的细胞中凋亡细胞升至17.80±2.34%,两组有显著性差异,P＜0.05。三、硼替佐米抑制PI3K/Akt通路,逆转胃癌细胞对TRAIL诱导凋亡的耐药1.50 ng/mL TRAIL处理SGC7901细胞1h可检测到Akt的磷酸化,其磷酸化水平随时间逐渐升高,8 h升至最高点,之后逐渐下降,16 h后降至基础水平。2.50 nM硼替佐米预处理SGC7901细胞2 h后,再以TRAIL处理8 h,磷酸化Akt水平不能被进一步提高,提示硼替佐米抑制了TRAIL引起的PI3K/Akt通路活化。50 uM的LY294002预处理细胞1 h后,再以TRAIL处理8 h,基线水平和TRAIL诱导的Akt磷酸化水平均被有效抑制,且LY294002对TRAIL诱导的Akt磷酸化水平的抑制与硼替佐米相似。3.TRAIL或LY294002单独作用于SGC7901细胞24 h后,亚二倍体细胞仅占5%左右,而两药联合后亚二倍体细胞升至18.38±0.77%,与TRAIL单药组相比有显著性差异,P＜0.05。结论1.人胃癌细胞系对TRAIL诱导的凋亡耐药。2.亚毒性剂量的硼替佐米可协同TRAIL抑制胃癌细胞增殖,促进细胞凋亡。3.硼替佐米促进caspases裂解,降低线粒体跨膜电位,下调抗凋亡蛋白cIAP-1,但对Bax,Bcl-2表达水平无明显影响。4.硼替佐米单独或与TRAIL联合可引起G2/M期阻滞,同时伴有Survivin表达上调。5.TRAIL可活化SGC7901细胞中NF-κB通路,特异性抑制NF-κB活性可部分逆转细胞对TRAIL诱导凋亡的耐药,提示在胃癌细胞中NF-κB主要发挥抗凋亡作用。6.TRAIL可活化胃癌细胞中PI3K/Akt通路,硼替佐米抑制TRAIL引起的PI3K/Akt通路活化,部分逆转细胞对TRAIL诱导凋亡的耐药。