研究背景腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm,AAA)是指患者局部腹主动脉瘤样膨大、扩张,通常直径增大50%以上定义为动脉瘤。据统计,其发病率超越颅内动脉瘤居各种动脉瘤发病率之首。该病进展的临床后果为急性瘤体破裂,而瘤体破裂后往往预后不佳,死亡率极高,约为80%。随着我国逐渐向老年化发展,腹主动脉瘤逐渐成为威胁老年人健康的常见疾病。目前,腹主动脉瘤只能通过手术治疗,尚未发现可用于临床治疗的特效药物。因此深入研究腹主动脉瘤的发病机理,寻找合适的药物靶点对于腹主动脉瘤的防治具有重要意义。目前认为动脉粥样硬化可以直接导致腹主动脉瘤的发生,其主要原因是由于肾下腹主动脉滋养血管缺乏,主要依靠上段滋养动脉的弥散作用供给营养。动脉粥样硬化斑块及其附壁血栓的形成,直接断绝了血液对肾下腹主动脉的滋养作用。同时,粥样斑块的形成减少了血流脉冲对血管壁动脉平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)的刺激作用,使其合成主动脉壁细胞外基质(extracellular matrix,ECM)和修复血管损伤的能力大大降低,并且在促进动脉内膜和中膜坏死的同时,导致血管壁细胞基质破坏、弹性蛋白的合成减少,最终使得血管弹性下降、管壁力量薄弱,在剪切应力下,使得腹主动脉出现瘤样扩张。研究揭示,在腹主动脉瘤发展过程中,主动脉中层动脉平滑肌细胞的凋亡和细胞外基质的代谢失衡在腹主动脉瘤的形成中起主要作用,其中蛋白酶的活性增加和弹性蛋白与胶原蛋白的缺失是细胞外基质代谢失衡的主要原因。ECM的主要成分为胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白多糖和糖蛋白等,是由细胞分泌到细胞外间质中的大分子物质,构成复杂的网架结构,支持并连接组织结构、调节组织的发生和细胞的生理活动。腹主动脉中,胞外基质主要参与维持动脉壁正常的抗张强度和弹性等,对于维持其正常的结构和生理功能起到重要作用。通常,胞外基质始终处于合成、降解的动态平衡中,其合成或者降解异常都有可能导致腹主动脉瘤的发病。VSMC是主动脉中膜的主要组成细胞类型,与ECM共同作用,稳定血管壁的机械强度。在腹主动脉瘤发展过程中,VSMC的作用包括合成基质、分泌蛋白酶、招募炎症细胞等。炎症作为促进腹主动脉瘤膨大的一个重要因素近年来被广为接受。外膜和中膜的炎症细胞以及他们分泌的细胞因子和蛋白水解酶可以产生持续的蛋白水解过程,使主动脉壁变薄,促进动脉瘤的扩张。阻止ECM的水解过程可以看作是治疗动脉瘤扩张的有效手段。环氧化酶2(Cyclooxygenase,COX-2)在动脉瘤壁中广泛表达,它可以使前列腺素E2(prostaglandinE2,PGE2)合成增加,这可能进一步造成胶原合成的减少。前列腺素E2(Prostaglandin,PGE2)不仅可以参与调节许多重要的生物学过程,还在抑制纤维化的过程中是起着有利作用的。非甾体抗炎药物可以通过抑制COX-2使得PGE2分泌减少。既往研究比较服用非甾体抗炎药物的15名患者和63名对照者,发现服用药物可以显著减慢腹主动脉瘤扩大的速度,此项研究提示非甾体抗炎药可以抑制动脉瘤发展。miRNA(Micro RNA)是一类长约20-24 nt的小非编码RNA。通过碱基部分互补配对的方式miRNA能结合靶基因的3’UTR区,从而在转录后水平抑制靶基因的表达。miRNA广泛参与各种生理过程的调控,包括器官发育、细胞分化、免疫反应等等。近年来,有研究指出miRNA也参与调控腹主动脉瘤的形成和发展。miR-29家族是胞外基质微环境的重要调节因子,它可以在转录水平上抑制胞外基质蛋白的表达,例如胶原、原纤蛋白及弹性蛋白。另外,miR-29是一个促纤维化相关因子,在纤维化相关疾病中可以作为潜在的治疗靶标。促纤维化应答机制通常被认为是病理性的,它的发生伴随着对器官和系统的重大损伤和影响。例如miR-29b下调己被确定是和控制心肌梗死和缺血后的心肌纤维化以及肝脏和肾脏纤维化是密切相关的。人们发现miR-29b在腹主动脉瘤组织中受到抑制,这意味着它很可能参与调控动脉瘤的发病过程。在腹主动脉瘤进展所引发的促纤维化过程中,胶原及其他基质蛋白表达的增加直接受miR-29b水平下降的控制。由此,进一步降低miR-29b的表达可能对抑制主动脉继续进展和最终破裂有潜在的作用。于是靶向降低miR-29b表达从而诱导促纤维反应的增强可能是抑制腹主动脉瘤进展一种有效手段。研究目的研究发现在腹主动脉瘤的患者中可以观察到大量的动脉平滑肌细胞细胞凋亡。而这一现象与炎症的发生有密不可分的联系。(既往动物实验以及临床研究发现,非甾体类抗炎药可以抑制PGE2合成,进而降低腹主动脉瘤中炎症反应与ECM的降解,从而抑制AAA发展。)我们的前期研究表明,PGE2可以上调VSMC中MiR-29b表达。本课题在前期研究基础上,明确PGE2上调VSMC中miR-29b表达后,能否调控VSMC中ECM的合成与分泌,从而探究PGE2以及非甾体类抗炎药在AAA中的作用以及相关机制,为腹主动脉瘤治疗提供新的靶标。更进一步希望通过本课题的开展为我们将miR-29b或PGE2合成相关基因作为腹主动脉瘤治疗的靶标奠定良好的理论基础。研究方法1.PGE2 对 miR-29b 的影响:通过用 500ng/mL 的 PGE2 和 10 mmol/L 非甾体抗炎药物吲哚美辛分别处理体外培养的动脉平滑肌细胞,定量PCR检测细胞内miR-29b的表达情况;进一步地,我们在大鼠AAA模型的腹主动脉瘤中验证该实验结果。我们将大鼠分为吲哚美辛治疗的实验组和未经治疗的对照组及假手术组,分别取各组大鼠的动脉瘤组织标本,定量PCR检测其中miR-29b的量。2.生物信息学预测miR-29b的靶位点,通过双荧光素酶报告基因检测miR-29b是否能够调控预测与其结合位点最多的COL1A1基因的启动子。并采用Western blot方法检测后者在动脉平滑肌细胞中的表达量是否受miR-29b的调控。3.评估PGE2以及对吲哚美辛血管平滑肌细胞VSMC胞外基质成分(包括胶原蛋白COL1A1、COL3A1、弹力蛋白和纤连蛋白)的作用效果;4.通过转染miR-29b inhibitor,沉默细胞中miR-29b的表达。从而判断PGE2对细胞外基质的影响是否通过调节miR-29b完成。5.动物水平的验证:经吲哚美辛治疗的AAA大鼠,检测其腹主动脉瘤组织中可溶性胶原含量并与未治疗的大鼠相比较,评价前列腺素抑制在动物体内的作用。研究结果1.前列腺素E2促使miR-29b表达量增加用PGE2处理的VSMC中miR-29b的表达量与未处理的细胞相比显著增加(2.162 ± 0.117vs 1.004 ± 0.010,P<0.001),这与之前的结果严格一致。用吲哚美辛处理细胞后,miR-29b的表达量明显下调,(0.665 ± 0.015vs2.162± 0.117,P<0.01)甚至比未经PGE2处理还要下调(0.665 ± 0.015 vs 1.004 ±0.010,,P<0.01)。经吲哚美辛治疗的AAA大鼠腹主动脉瘤组织内miR-29b的量要明显低于未治疗组大鼠,差异有统计学意义(P<0.05)。2.miR-29b可以直接靶向调节COL1A1基因从TargetScan得到的数据结果显示,COL1A1是一个可能的miR-29b下游靶基因,miR-29b与COLA1 3’-非编码末端(UTR)上的至少三个位点存在相互作用。我们将COL1A1的3’-UTR结合位点序列与miR-29b直接转染细胞中,观察荧光强度变化,判断COL1A1是否能与miR-29b互补结合。在miR-29b mimics存在的情况下,转染有COLL41 3’-UTR的动脉平滑肌细胞的荧光强度较未转染细胞有很大程度下降,下降到原来的一半左右(P<0.01);而共转染COL1A13’-UTR和Scr-miR的细胞,与未转染细胞相比荧光强度没有显著变化。这说明荧光强度的变化是由miR-29b mimics引起的,由此我们可以判断,COL1A13’-UTR和miR-29b是有直接相互作用的。我们进一步通过定量PCR分析方法,评估miR-29b对VSMC中COL1A1表达水平的影响。结果表明,与未转染细胞相比,miR-29bmimics转染的ASMC细胞中COL1A1的表达量在mRNA水平上显著减少且有统计学意义(0.587±0.178VS 1.000± duoshao,P<0.05)。而 miR-29b 抑制剂则显著增加了COL1A1的表达量(1.630±0.203± duoshao,P<0.01)。这些结果表明,miR-29b 对COL1A1的抑制作用是通过直接靶定其3’-UTR序列实现的。采用western blot方法在蛋白水平上验证miR-29b对COL1A1的抑制作用。转染miR-29bmimics的细胞表达COL1A1的量较未转染细胞或转染对照miR-src的细胞表达量低很多;而转染miR-29b inhibitor的细胞中,COL1A1蛋白的表达量明显增加,进一步说明miR-29b对COL1A1表达有抑制作用。3.前列腺素E2可以通过miR-29b促进VSMC中胞外基质降解前列腺素E2处理后,COL1A1和COL341mRNA表达明显被抑制(分别是处理前的0.690±0.193倍和0.710±0.145倍,P<0.05)。同样,前列腺素E2也抑制动脉平滑肌细胞中弹性蛋白ELN和纤连蛋白FBN1的表达(分别是原来的0.657±0.105倍和0.643±0.235倍,P<0.01)。值得注意的是,在吲哚美辛的刺激下各种胞外基质成分的表达水平增强,以对其做出应答。我们推测这可能是由于前列腺素E2可以增加miR-29b的表达量,而miR-29b又可以抑制胞外基质胶原基因的表达,进而推测PGE2的作用是否是通过调节miR-29b完成的。首先用RT-PCR检测miR-29b抑制剂对其的抑制效果,结果表明即使在有前列腺素E2存在的情况下,抑制剂也可以成功抑制miR-29b的表达(表达量低于未转染前的30%)。虽然PGE2可以降低胞外基质的表达量,但当转染有miR-29b inhibitor时,其表达量反而是增加的,比不处理的细胞还要高。由此可知,miR-29binhibitor对胞外基质的影响作用较前列腺素要强,之前我们推测前列腺素E2可能由于增加了细胞内miR-29b的产生,使基质基因表达量下调,而抑制剂不但可以抵抗这种效果,还可以抑制细胞内miR-29b的本底表达量。由此转染有miR-29binhibitor的细胞即使经前列腺素刺激,其miR-29b的水平还是很低,进一步解除了对胞外基质分泌的限制,使胶原和弹性、纤连蛋白等分泌增加。4.前列腺素E2通过miR-29b降低VSMC中可溶性胶原的分泌我们进一步检测由动脉平滑肌细胞分泌可溶性胶原的量加以验证。在前列腺素的刺激下,可溶性胶原的表达量明显下降(P<0.05)。当用吲哚美辛处理细胞阻碍了细胞本身前列腺素合成的时候,胶原的比例大幅度上升(P<0.01)。说明PGE2可以调节细胞外基质的合成。转染miR-29b inhibitor时,前列腺素E2的影响被抵消;而转染miR-29b mimics时,前列腺素E2的作用加剧。5.前列腺素E2抑制剂可以提高大鼠腹主动脉瘤组织中可溶性胶原蛋白含量。为进一步确认吲哚美辛在动物体内的疗效以及探究其可能的机制,我们检测了吲哚美辛治疗的AAA大鼠及未经治疗的AAA大鼠腹主动脉瘤组织中可溶性胶原蛋白的含量。吲哚美辛治疗的AAA大鼠腹主动脉瘤组织中可溶性胶原蛋白的含量要明显高于未经治疗的大鼠,差异有统计学意义(P<0.05)。结论首先,PGE2对动脉平滑肌细胞中miR-29b的合成有强促进作用。经PGE2抑制剂吲哚美辛治疗后,大鼠体内PGE2的合成受到抑制,从而使miR-29b表达量下降;在动脉平滑肌细胞中,miR-29b可以通过直接结合COLL41 3’-UTR的结合位点,靶向下调它的表达量。PGE2可以促进动脉平滑肌细胞外基质降解,且PGE2的这种作用是通过调节miR-29b完成的,并且可以被吲哚美辛的作用所拮抗。动物实验进一步表明吲哚美辛在实际应用中可能的用途:通过调节PGE2来改变miR-29b的含量,从而导致细胞外基质中胶原及其他纤维相关蛋白分泌增加。我们推测,胞外基质的增加可能会通过限制动脉瘤的进一步扩张从而阻碍动脉瘤进展,但本文尚未有确切证据证实此推论,相关的验证实验还在进行。