发酵乳制品在保存过程中仍能进行缓慢发酵，酸度继续积累，导致发酵乳制品过酸味以及感官品质下降的后酸化（postacidification）现象发生。德氏乳杆菌乳酸亚种是发酵乳中最常用的发酵剂菌种之一，在发酵乳制品的后期保存中，因继续发酵产酸，成为引起发酵乳制品后酸化的主要原因。本项研究通过新霉素“加压”环境获得弱化H⁺-ATPase的德氏乳杆菌乳酸亚种菌株（Lactobacillus delbrueckii subsp．lactis），研究德氏乳杆菌乳酸亚种的H⁺-ATPase生理活性变化，探索其H⁺-ATPase生理活性与其发酵乳酸化活性间的相互关系，旨在为控制发酵乳品的后酸化发展，改善最终制品在贮存期间的风味及品质变化提供理论依据。主要研究结果如下：1．采用含有新霉素（neomycin sulfate，400μg／mL）的改良MRS培养基，以德氏乳杆菌乳酸亚种（L．delbrueckii subsp．lactis，L5）为出发菌株，选育获得3株低活性H⁺-ATPase突变菌株5M6、5M1和5B1。以出发菌株L5为对照，突变株5M6、5M1和5B1的H⁺-ATPase活性分别下降了51．3％、27．7％和34．3％。新霉素敏感试验、菌株在MRS培养基37℃厌氧培养24h后的生物量及乳酸度数据显示，突变株5M6、5M1和5B1在转接8代后，这些指标变化不大，证实突变株的遗传性状稳定，可作为进一步的研究菌株。2．以出发菌株L5为对照，对突变株5M6、5M1和5B1的生理学特性研究表明：①无论以MRS还是脱脂乳作为培养介质，突变株5M6、5M1和5B1在细胞形态上均较出发菌株细长。②与出发菌株相比，突变株5M6、5M1和5B1的β-半乳糖苷酶活性明显降低，分别降为出发菌株的3．42％、2．56％和2．12％。③在MRS培养基中37℃厌氧培养18h后，出发菌株L5的ATP含量明显低于突变株，其中，菌株L5的ATP含量约为0．63×10^-18mol／个；突变株5M6和5B1的ATP含量分别为1．18×10^-18mol／个和1．38×10^-18mol／个；突变株5M1的ATP含量最高，约为1．60×10^-18mol／个。④在pH4．2、5．2和6．2的MRS培养基中37℃厌氧培养24h后，与pH6．2相比较，在pH4．2时，突变株5M1、5M6和5B1的生物量较出发菌株L5明显降低。其中，突变株5M1、5M6和5B1分别下降了83．9％、73．6％和69．6％，出发菌株L5下降了52．0％。⑤在NaCl浓度为1％、3％和5％的MRS培养基中37℃厌氧培养24h后，与不加NaCl时相比较，NaCl浓度为5％时，突变株5M1、5M6和5B1的生物量下降明显高于出发菌株L5，其中，突变株5M1、5M6和5B1分别下降了94．1％、88．5％和79．7％，出发菌株L5下降了50．5％。⑥以脱脂乳作为培养介质，37℃厌氧培养48h后，接种出发菌株L5的发酵乳中的乳酸度为2．02％，培养介质的pH为3．28；接种突变株5M1、5M6和5B1的发酵乳的乳酸度分别为0．48％、0．76％和0．50％，pH分别5．40、5．22和4．52。这些数据显示，与出发菌株L5相比，突变株5M1、5M6和5B1酸化活性显著下降。⑦以出发菌株L5为对照，采用HPLC分析突变株5M6、5M1和5B1的氨基酸利用及代谢状况表明，在MRS培养基中37℃厌氧培养12h后，出发菌株L5转化谷氨酸到γ-氨基丁酸的比率为13．9％，明显低于突变株5M1、5M6和5B1的转化比率。其次，突变株间在转化谷氨酸到γ-氨基丁酸的比率上也存在差异，其中，突变株5M6转化比率最高，为16．7％；菌株5M1居中，为15．6％；菌株5B1最低，为15．4％。当在MRS培养基中37℃厌氧培养18h后，4株菌转化谷氨酸到γ-氨基丁酸的比率均有提高，其中，出发菌株L5的转化率为15．1％，但明显低于突变株5M1、5M6和5B1的转化率；突变株5M6的转化率最高，为17．3％，突变株5B1居中，为17．0％，菌株5M1最低，为16．2％。3．德氏乳杆菌乳酸亚种的H⁺-ATPase的酶学性质研究表明：①该酶的分子量为126．0KD，最适反应时间为5min，最适反应温度为42℃，最适反应pH为7．5。ATP作为底物的最适添加量为3mmol／L。②H⁺-ATPase活性受金属离子的影响，K⁺、Na⁺和Mg²⁺对H⁺-ATPase活性有促进作用，其中Mg²⁺的促进最明显，5M1、5M6、5B1和L5的H⁺-ATPase活力分别提高了107．0％、45．9％、163．0％和16．7％；Ba²⁺、Mn²⁺、Al³⁺和Li⁺离子对H⁺-ATPase活性有明显抑制作用，其中Al³⁺的抑制最明显，突变株5M1、5M6和5B1以及出发株菌L5的H⁺-ATPase活力分别下降了76．0％、81．7％、60．4％和93．4％。③H⁺-ATPase活性受特异性抑制剂DCCD的影响，DCCD浓度为60mmol／L时，H⁺-ATPase活性明显下降，出发菌株L5以及突变株5M6、5M1和5B1分别下降了87．6％、63．9％、32．8％和72．1％。④菌体在不同的培养时间，其H⁺-ATPase活性也不同。突变株5M1、5M6和5B1以及出发菌株L5的H⁺-ATPase活力均出现两个峰值，分别在8h和24h。培养8h后，突变株5M1、5M6和5B1以及出发菌株L5的H⁺-ATPase活力分别为0．25U、0．40U、0．24U和4．55U，培养24h后，突变株5M1、5M6和5B1以及出发菌株L5的H⁺-ATPase活力分别为0．18U、0．30U、0．19U和3．80U。4．分别将出发菌株L5及突变菌株与嗜热链球菌菌株S（Streptococcusthermophilus S）两两搭配，按2％接种量分别接种到12％的巴氏灭菌脱脂乳中，42℃培养至凝乳并4℃冷藏至30d后的结果表明：①无论是突变株还是出发菌株存在下，发酵乳的凝乳时间均在3．5～4h。4℃贮存5d，由菌株L5制备的发酵乳的滴定乳酸度为1．22％，pH为3．87；而由突变株5M1、5M6和5B1制备的发酵乳的滴定乳酸度分别为0．76％、0．76％和0．88％，pH分别为4．26、4．24和4．22。4℃贮存10d，由菌株L5制备的发酵乳的滴定乳酸度为1．35％，pH为3．75；由突变株5M1、5M6和5B1制备的发酵乳的滴定乳酸度分别为1．12％、1．17％和1．13％，pH分别为4．15、4．05和4．08。显然，与对照菌株L5相比，采用突变株5M1、5M6和5B1制备的发酵乳品可以在规定的货架期内保持较低的酸度积累，推迟了发酵乳品后酸化出现的时间至少5d。②对4株菌的发酵乳感官评定表明，由突变株5M1、5M6和5B1制备的发酵乳风味口感方良好；SDS-PAGE证实，与对照菌株L5制备的发酵乳蛋白组分相比，由突变株5M6、5M1和5B1制备的发酵乳蛋白组分变化不大。③接种商业化的益生菌干粉制剂嗜酸乳杆菌NCFM（Lactobacillus acidophilusNCFM）到上述发酵乳中，4℃贮藏21d后，益生菌（NCFM）在L5制备的发酵乳的活菌数为9．0×10⁷cfu／mL；在由突变株5M1、5M6和5B1制备的发酵乳中的活菌数均在10⁸cfu／L以上，分别为1．5×10⁸cfu／mL、1．3×10⁸cfu／mL和1．5×10⁸cfu／mL。显然，采用弱化H⁺-ATPase活性的菌株来制备发酵乳，对于改善益生菌的存活效果也是非常有益的。