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【研究背景】支气管哮喘（哮喘）是儿童最常见的气道慢性炎症性疾病,近年来在我国有持续上升的趋势。哮喘已经成为全球关注的公共卫生问题,从哮喘发病机制水平寻找干预措施是迫切需要解决的临床实际问题。哮喘病因复杂,与遗传背景、环境因素、免疫功能均密切相关。经典的免疫学说认为哮喘发病与Th1/Th2细胞功能失衡相关。因此,纠正Th细胞平衡是哮喘免疫治疗的关键。协同刺激分子不但能够调控T细胞免疫应答,而且在Th细胞分化中也发挥了重要的作用。B7-H3是B7家族新成员,且结构学和功能学都提示B7-H3是调控T细胞生物学活性的关键分子,但对Th细胞的调控作用尚存在争议。近来研究发现微小RNA（miRNA）可以在转录或转录后水平来调控相关基因表达而在免疫炎症性疾病中起重要作用。研究表明B7-H3的表达也受miRNAs的调控。【目的】本项目旨在通过体内外实验,阐明非编码RNA调控B7-H3的作用及机制,以及B7-H3调控Th细胞分化的作用及其在支气管哮喘中表达的临床意义,为更全面的认识共刺激分子B7-H3在哮喘发病中的作用提供新的线索。【方法】选取于2013年6月2015年12月在苏州大学附属儿童医院呼吸科住院并符合我国儿童支气管哮喘诊断和治疗指南诊断标准的中-重度哮喘急性发作患儿21例。选取同期在苏州大学附属儿童医院外科行择期手术（腹股沟斜疝、血管瘤、多指并指）的患儿18例作为对照组。两组年龄比较无差异性。同时收集患儿临床和实验室检查资料。患儿入院时和出院时收集外周血标本,ELISA检测IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17和可溶性B7-H3（sB7-H3）。流式检测单个核细胞表面B7-H3表达。分离人外周血T细胞,磁珠分离纯化CD4+CD45RA+初始性T细胞,将CD4+CD45RA+初始性T细胞浓度调整为5×105。加入不同浓度的B7-H3融合蛋白（0.6μg/ml、3μg/ml和15μg/ml）,24h后收集细胞和上清。实时定量PCR检测Th1、Th2、Th17、Treg标志性转录因子T-bet、GATA-3、RORγt、FOXP3表达量;ELISA检测Th1、Th2、Th17、Treg标志性细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17、TGF-β表达量。基因芯片分析哮喘患儿单个核细胞差异表达的miRNA,且通过生物信息学软件预测B7-H3靶基因相关miRNAs,并通过实时PCR验证。构建过表达或沉默表达miR-29c慢病毒载体,并转染THP-1,观察B7-H3表达变化。荧光素酶报告系统明确miR-29c与B7-H3-3’UTR能否结合。采用定量PCR检测52例哮喘患儿和26例健康对照儿童外周血单个核细胞中miR-29c表达情况。构建OVA致敏的哮喘小鼠模型,腹腔注射给予阻断型抗B7-H3单克隆抗体或B7-H3融合蛋白,收集小鼠支气管肺泡灌洗液进行细胞总数计数及分类计数。采用ELISA法测定小鼠BALF及血浆中的IFN-γ、IL-4、IL-17的水平。小鼠肺组织切片行HE染色、PAS染色及B7-H3免疫组化,观察肺组织炎性细胞及嗜酸性粒细胞浸润情况、气道粘液分泌情况及肺组织B7-H3表达情况。【结果】哮喘急性发作儿童外周血CD14+单核细胞表面mB7-H3呈高表达,较健康对照儿童显著增高（P>0.05）。哮喘急性发作期患儿血浆sB7-H3、IL-4、IL-17浓度较健康对照组明显升高（P均<0.05）,而血浆IFN-γ水平显著低于健康对照组（P<0.05）。血浆IL-10水平两组间无差异性（P>0.05）。使用ICS吸入治疗的患儿入院时sB7-H3水平要显著低于未予ICS正规吸入治疗的患儿（t=2.706;P=0.0136）。哮喘急性发作患儿血浆sB7-H3与IFN-γ呈负相关（r=0.644;P=0.002）,且与FEV1%预计值也呈负相关（r=0.499;P=0.0212）。恢复期血浆sB7-H3表达水平显著下降（P=0.003）。B7-H3融合蛋白可以促进GATA-3、RORγt表达增加,且对RORγt的作用存在剂量依赖性。B7-H3融合蛋白高浓度组（15μg/ml）能促进Th2标志性转录因子GATA-3高表达。B7-H3融合蛋白可以促进IFN-γ、IL-4、IL-17A表达增加,且对IL-4、IL-17A的作用存在剂量依赖性（P<0.05）,尤其是对IL-17A的影响最为显著。同时,B7-H3融合蛋白高浓度组（15μg/ml）能促进Th1标志性转录因子IFN-γ高表达（P<0.05）。基因芯片和生物信息学预测B7-H3是miR-29c的靶基。miR-29c+B7-H3-3’UTR野生型组荧光素表达量显著降低,而其他组miR-29c+B7-H3-mut-3’UTR、miR-NC+B7-H3-3’UTR野生型、miR-NC+B7-H3-mut-3’UTR、miR-29c+荧光素酶空载组萤光素酶检测数值没有变化,证实miR-29c靶基因为B7-H3。过表达或沉默表达miR-29c可以下调或上调THP-1细胞B7-H3的表达。哮喘急性发作患儿外周血miR-29c浓度显著低于健康对照组（P<0.01）。哮喘小鼠BALF中炎性细胞和嗜酸性粒细胞均增多,抗B7-H3抗体效应期组和IgG对照组细胞学分类无差异性。抗B7-H3抗体诱导期组细胞总数及嗜酸性细胞数与IgG组比较显著降低（P<0.05）。与哮喘组、IgG组、抗B7-H3单克隆抗体效应期组比较,抗B7-H3单克隆抗体诱导期组气道和肺泡周围炎性细胞及嗜酸性细胞浸润显著减少,粘液分泌减少。与IgG对照组比较,抗B7-H3抗体效应期治疗组IFN-γ、IL-4、IL-17的水平无显著性差异（P>0.05）,但抗B7-H3抗体诱导期治疗组INF-γ水平升高,IL-4、IL-17水平降低（P均<0.05）。与IgG对照组比较,B7-H3融合蛋白组小鼠BALF中细胞总数及嗜酸性粒细胞显著增高（P<0.05）。TLR2-/-小鼠B7-H3融合蛋白组相比TLR2-/-哮喘组小鼠总细胞数和嗜酸性细胞比例也有显著升高（P<0.05）。B7-H3融合蛋白组小鼠气道和肺泡周围炎性细胞、嗜酸性细胞浸润及粘液分泌显著增加。TLR2-/-小鼠B7-H3融合蛋白组较TLR2-/-哮喘小鼠肺组织病理改变更重,粘液分泌更明显（P均<0.05）。与IgG对照组比较,B7-H3融合蛋白组小鼠BALF中IFN-γ、IL-4水平增高。TLR2-/-小鼠B7-H3融合蛋白组BALF中IFN-γ、IL-4和IL-17水平均较TLR2-/-哮喘组显著升高（P均<0.05）。【结论】B7-H3通过促进Th细胞分化而在哮喘的发生发展中起重要作用,尤其是对Th1、Th2、Th17分化作用更为显著。B7-H3融合蛋加重哮喘免疫病理,其机制不清,并不依赖于TLR2。在诱导期而非效应期,抗B7-H3单克隆干预可以减轻哮喘免疫病理。因此,B7-H3有望成为哮喘治疗的新靶点以及预后评估的有效指标。