赖氨酸脱羧酶（简称LDC）是生物体内可逆地催化L-赖氨酸脱羧生成1，5-戊二胺和CO2的高度专一性酶。1，5-戊二胺是工业上一种重要的五碳化合物，可以用于合成有机原材料、中间产物或相关化学品，广泛应用于农业、医学、工业等领域。本论文通过利用易错PCR和DNA改组等分子定向进化技术，提高赖氨酸脱羧酶活性，从而达到缩短L-赖氨酸转化时间、增强酶催化效率及提高目标产物1，5-戊二胺产率的实验目的。　　LDC广泛存在于大肠杆菌（Escherichia coli）、尸胺杆菌（Bacterium cadaveris）、蜂房哈夫尼菌（Hafnia alvei）等大多数微生物中，其也存在于一些高等植物中，如家山黧豆、黄瓜等等。经研究发现，其中cadA和ldcC（来自于E.coli）、ldc(来自于H.alvei)三种典型的赖氨酸脱羧酶的活性较高，在近些年备受科研工作者的关注。本论文前期在E.coli JM109中（以pTrc99a为载体）分别单独克隆表达cadA、ldcC和ldc三种赖氨酸脱羧酶基因，经酶活测定，测得cadA和ldcC的比酶活分别为1652U/mg、1329U/mg; ldc的比酶活为2466U/mg。　　为了进一步提高赖氨酸脱羧酶比酶活，本论文通过建立高通量筛选方法，利用易错PCR和DNA改组两种蛋白质体外定向进化技术对上述典型赖氨酸脱羧酶进行不同分子改造，最终获得一株活性提高的突变菌株，并采用海藻酸钠-壳聚糖作为固定化细胞的载体，对突变菌株进行固定化，从而进一步提高1，5-戊二胺生产菌株的高效转化率和重复利用率。主要研究结果如下:　　(1)易错PCR:以H.alvei AS1.1009基因组为模板，通过调整反应条件（如提高Mg2+浓度、加入Mn2+、改变体系中4种dNTPs浓度、改变Taq酶浓度等等），采用Taq酶体系进行PCR扩增赖氨酸脱羧酶活性最高的ldc基因，克隆至pTrc99a表达载体，用CaCl2转化法转至E.coli JM109中成功表达。经第一轮高通量筛选获得约32个酶活有所提高的突变株。　　(2) DNA改组:首次尝试采用两种不同的DNA改组方法定向进化赖氨酸脱羧酶。　　①DNaseⅠ法:以第一轮易错PCR产物为实验模板，利用DNaseⅠ进行消化，得到约50-100bp的随机片段，随后进行无引物PCR，重聚这些随机片段（电泳呈弥散状条带），再进行有引物PCR，获得特异性目的条带（2.0kb左右）②多种限制性内切酶法:选取第一轮易错PCR活性较高的ldc基因片段和cadA基因片段为实验材料，分析两个基因中存在的限制性酶切位点，分别对两个基因进行酶切，获得不同大小的基因片段混合物，再进行有引物PCR获得特异性目的条带。分别将上述两种方法获得的目的基因克隆至pTrc99a表达载体，连接转化至E.coli JM109。经第二轮高通量最终筛选得到比酶活提高了2倍的突变株E.coli JM109/pTrc99a-LDC-2-41，目标产物1，5-戊二胺的转化率为91.2％。通过测序及序列比对，发现突变株较原始菌株有两个氨基酸位点发生了突变:V147F和E583G。利用Swiss-Model在线比对软件和Pymo(ll).3蛋白质结构分析软件，根据Genbank现有赖氨酸脱羧酶三级结构模型，建立突变株的赖氨酸脱羧酶模型，并分析其三级蛋白结构对酶活的影响。　　(3)固定化E.coli细胞制备1，5-戊二胺:本论文采用海藻酸钠-壳聚糖作为固定化细胞的包埋载体，戊二醛作交联剂，最终选出最优固定化条件:海藻酸钠浓度2.5％(w/v)、壳聚糖浓度3.5-4.5％(w/v)、戊二醛浓度0.5％(v/v)、CaCl2浓度2.0％(w/v)、交联时间3.5h、固定化时间4h、底物浓度70g/L。考察最适温度(37℃)及温度稳定性、最适pH(6.0)及pH稳定性对固定化赖氨酸脱羧酶细胞的影响，并通过扫描电镜(SEM)进一步分析固定化细胞的结构。固定化细胞重复利用率实验结果表明，细胞在70g/L赖氨酸转化液连续反应6次，目标产物1，5-戊二胺转化率仍然保持在80％以上。