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拟南芥隐花色素CRYPTOCHROME作为蓝光受体,在植物生长和发育中发挥着重要作用。拟南芥隐花色素CRY1和CRY2在蓝光下会首先经历磷酸化,然后通过蓝光依赖的方式与其它蛋白相互作用,将蓝光信号传递给下游蛋白。这种蓝光依赖的磷酸化伴随蓝光信号转导的起始,与其功能正相关。然而迄今为止,隐花色素CRY蓝光依赖磷酸化的分子机制尚不清楚。本实验室以拟南芥CRY2为诱饵筛选拟南芥c DNA酵母文库,发现4个在蓝光下能与CRY2特异互作的蛋白激酶,并将其分别命名为PPK1,PPK2,PPK3和PPK4(Photoregulatory Protein Kinase,PPK),该发现为揭示隐花色素CRY2蓝光特异磷酸化的分子机制找到新着手点。通过酵母双杂交液体显色实验和植物体内CRY2互作蛋白质谱检测发现,PPK1,PPK2,PPK3和PPK4均可以蓝光依赖地与CRY2发生相互作用,表明PPKs可能是一直寻找的CRY2蛋白激酶。人类胚胎肾细胞(HEK293T)中共表达拟南芥CRY2和PPKs发现,蓝光下CRY2会在SDS聚丙烯酰胺凝胶上形成迁移变慢的上移条带,而这种上移条带会被磷酸酶消化除去,这就表明CRY2与PPKs共表达时会被PPKs磷酸化。同样条件下,CRY2分别与其它蛋白激酶(CK1.3,CK1.4或是MAPK12)共同表达时,并没有出现迁移慢的磷酸化条带,表明PPKs磷酸化CRY2的特异性。HEK293T细胞中CRY2磷酸化动态分析显示,与植物中CRY2磷酸化模式一样,PPKs对CRY2的磷酸化程度依赖于蓝光处理时间和强度。质谱分析拟南芥CRY2磷酸化位点实验中发现,至少18个丝氨酸位点和6个苏氨酸位点可能会发生磷酸化,其中7个丝氨酸位点(S506,S523,S525,S526,S598,S599和S605)在三次独立实验中均被检测到,可信度较高。将PPK1,PPK2和PPK3分别与CRY2在HEK293T中共同表达,同样进行CRY2磷酸化位点质谱检测分析发现,CRY2仍主要在上述7个丝氨酸位点(S506,S523,S525,S526,S598,S599和S605)发生磷酸化,与植物体内CRY2磷酸化位点匹配。而CK1.3,CK1.4蛋白激酶和PPK1催化失活突变体PPK1D267N分别与CRY2共表达时,CRY2中并未检测到明显的磷酸化位点,综合这些结果进一步证明PPKs是CRY2特异的蛋白激酶。结合以上实验结果,随后分析了植物体内PPKs对CRY2生化活性和生物功能的影响。由于PPK基因功能的冗余性,实验中主要以ppk123和ppk124三突变体以及多PPK基因干扰株系ami R4K为材料进行分析。与cry2突变体一样,ppk123,ppk124和ami R4K均表现出长日条件下开花时间延迟且FT m RNA表达显著下调。重要的是,这三种基因型植株中CRY2磷酸化明显受到破坏,磷酸化依赖的泛素化降解也同样受到影响。综合上述结果,表明植物体中PPKs在蓝光下磷酸化CRY2并促进CRY2的生物活性及其蓝光依赖的泛素化降解。隐花色素CRY2经历蓝光依赖磷酸化后会被快速降解,且该过程通过泛素化-蛋白酶体途径完成。泛素化介导的蛋白降解过程是一种终止隐花色素介导信号转导的重要方式,但目前拟南芥CRY2特异的E3连接酶仍未被发现,其泛素化降解的分子机制仍不清晰。本研究主要利用分子遗传学手段,分析不同基因型突变体中CRY2的稳定性,进而解析CRY2蓝光依赖泛素化降解的分子机制。曾有文献指出ZTL和LKP2通过介导蓝光信号抑制CRY2信号途径互作蛋白CIB1的降解。而通过分析ztl-3和ztl/lkp2突变体中CRY2的降解情况发现,CRY2的稳定性并未发生变化,表明ZTL和LKP2并不介导蓝光信号参与调节CRY2的泛素化降解。cul4-1突变体中CRY2的稳定性提高,说明COP1/SPA1更可能是作为E3连接酶与CUL4形成复合体影响CRY2的泛素化降解,而不是作为CRY2信号途径里的互作蛋白产生影响。然而,在cul4-1,cop1-5和spa1234突变体中,CRY2的泛素化降解只是被部分破坏,暗示着存在其它E3泛素连接酶参与调节CRY2蓝光依赖泛素化降解。正如假设,实验发现相比于野生型植株cul1突变体中CRY2在蓝光下的稳定性显著提高,也就说明CUL1依赖的E3泛素连接酶参与了CRY2的蓝光依赖泛素化降解。结合以上实验结果,我们推断蓝光下CRY2会经历由CUL1依赖的E3泛素连接酶和CUL4依赖的E3泛素连接酶催化的泛素化降解,进一步阐明了CRY2蓝光依赖泛素化降解的分子机制。