β-甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78），是一类能够水解含β-1，4-D-甘露糖苷键的内切水解酶，属于半纤维素酶类。水解的底物有半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳葡萄甘露聚糖和甘露聚糖，产物有少量的单糖和2～10个单糖分子构成的寡糖。随着对自然界半纤维素资源的开发和甘露寡糖药用价值的发现，β-甘露聚糖酶的研究和开发进入一个新高潮。它已在食品、医药、造纸、纺织印染、石油开采及生物技术等多方面得到了广泛运用。假密环菌（Armillariella tabescens）为白磨科真菌，寄生于树干基部或根部，引起多种树木腐病，菌体可食用。但除了本实验室研究外，尚未见到有关A．tabescensEJLY2098能产β-甘露聚糖酶的报道。实验室前期的研究工作表明A．tabescensEJLY2098能产生两个β-甘露聚糖酶活性组分：一个为β-甘露聚糖酶P1，另一个为β-甘露聚糖酶P2（79K）。前期的工作完成了P2（79K）的分离纯化、酶学性质分析，以及46K的基因克隆与表达。本论文的目的是：1．采用柱层析方法从天然菌株A．tabescens EJLY2098中分离纯化β-甘露聚糖酶46K并作酶学性质分析；2．利用蛋白质N端序列测定来设计简并引物，再通过SMART—RACE技术来克隆全长基因的路线，对天然菌株A．tabescens EJLY2098中分泌产生的β-甘露聚糖酶（P2）79K进行基因克隆工作。首先利用魔芋精粉为唯一碳元，对天然菌株A．tabescens EJLY2098进行诱导培养产β-甘露聚糖酶，然后设计了三个不同纯化方案：1)分子筛Sephadex G-25、离子交换和疏水层析；2)分子筛Sephadex G-25、离子交换和分子筛Sephadex G-75；3)DEAE—阴离子交换层析；分别对β-甘露聚糖酶P1进行纯化。经过实验，DEAE—阴离子交换层析成功的从A．tabescens EJLY2098的菌液上清中分离纯化出β-甘露聚糖酶P1（命名为β-甘露聚糖酶47K）。β-甘露聚糖酶47K纯化倍数为12.07，回收率3.2％；SDS-PAGE分析该酶分子量约为47kD，等电点pI约为5.6-5.7；HPTLC分析，该酶为内切β-甘露聚糖酶；酶学性质分析表明：β-甘露聚糖酶47K的酶促反应最适温度为50℃，酶促反应最适pH为5.0-6.5；在温度为30℃-60℃，pH 5.0～6.5之间时该酶的稳定性较好；Na+和Ba2+对该酶有激活作用。与重组表达的β-甘露聚糖酶P1（即β-甘露聚糖酶47K）相比较：酶反应最适温度要低些，而最适pH、热稳定性两者基本相同，重组的β-甘露聚糖酶47K的pH 4.0～5.5之间稳定性较好。本文尝试对β-甘露聚糖酶组分79K（P2）进行基因克隆。首先对粗分离的P2进行Native-PAGE电泳分离并检测活性和分析分子量，选取分子量为79kD的活性带进行蛋白质序列的N端测定，得到了九个氨基酸：AFLNVDLDF。以此序列为基础设计上游引物，分别与三种不同下游引物（（1）OligodT20，（2）LA试剂盒提供的引物M13PrimerM4，（3）利用NCBI蛋白质数据库依据同源性设计下游简并引物）进行克隆。最后利用（3）设计的下游引物，通过RT-PCR获得一个约380bp的基因片断，blastx分析结果，该片断和其它β-甘露聚糖酶的同源性不高，从片段大小和同源性看，本工作尚未克隆出β-甘露聚糖酶组分79K（P2）的基因。本文成功的从天然菌株A．tabescens EJLY2098的菌液上清中分离纯化出来了β-甘露聚糖酶47K，并对其进行了比较全面的酶学性质分析；利用不同的引物，对从蛋白质开始，克隆一个未知的基因进行了初步探索．为全面了解A．tabescens EJLY2098产生的β-甘露聚糖酶的性质作了部分重要的工作。