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新城疫（Newcastle disease,ND）属于高度接触性传染性疾病,由于传播十分迅速,感染率与死亡率高,给养禽业造成了严重的经济损失。防控新城疫的策略包括生物安全措施与疫苗接种等,疫苗主要分为灭活疫苗、弱毒疫苗与病毒载体疫苗,其中火鸡疱疹病毒（Herpesvirus of turkey,HVT）载体疫苗相对于其他疫苗具有突出优势,可以十分有效地防控新城疫。传染性法氏囊病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）属于双RNA病毒科,主要靶器官为鸡的法氏囊。近几年我国出现IBDV新型变异株（nVarIBDV）的流行,感染后虽然不会导致鸡的直接死亡,但是可致法氏囊萎缩,引起鸡的免疫抑制,严重威胁养禽业的健康发展,并且现有疫苗对nVarIBDV无法提供保护。为了构建同时针对NDV和nVarIBDV的重组火鸡疱疹病毒（rHVT）,并且避免两种rHVT疫苗的接种可能对动物造成的影响,本研究运用NHEJ-CRISPR/Cas9和Cre/LoxP系统,首先构建了只表达基因Ⅶ型NDV F蛋白的重组病毒rHVT-Fopt,同时鉴定该重组病毒的体外生物学特性并对其免疫效力进行评价。结果表明重组病毒rHVT-Fopt外源蛋白表达良好,与HVT亲本株的体外复制速率无显著差异,使用此疫苗免疫1日龄SPF鸡能够对NDV强毒株的攻击产生完全保护。之后以构建好的rHVT-Fopt为骨架,运用类似的方法将nVarIBDV/SN1905-2株的VP2基因插入rHVT-Fopt重组病毒中,成功得到两株共表达基因Ⅶ型NDV F蛋白和nVarIBDV VP2蛋白的rHVT病毒。两株rHVT病毒均有良好的遗传稳定性,具有同时防控ND和IBD的潜力,并且为之后构建多联多价rHVT疫苗奠定了一定的基础。1.表达NDV F蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建为了构建HVT-ND重组疫苗,本文构建了 CRISPR/Cas9基因编辑质粒,同时构建了野生型与密码子优化的基因Ⅶ型NDV F基因的转移载体质粒,将两个质粒分别转染CEF细胞后通过IFA和Western blot分析比较了野生型与密码子优化的F蛋白的表达水平,选择F蛋白表达水平高的转移载体质粒,在CEF细胞中与基因编辑质粒共转染,之后接种HVT病毒,通过eGFP荧光标签筛选纯化重组病毒,并对其进行PCR和IFA鉴定外源蛋白表达情况,得到共表达eGFP和F蛋白的重组病毒。接下来在CEF细胞中转染pcDNA3.1-Cre质粒后接种荧光重组病毒,对不发出荧光的重组病毒进行筛选纯化,将PCR和IFA鉴定正确的重组病毒进行体外遗传稳定性和复制动力学的测定。结果表明,成功构建表达密码子优化的基因Ⅶ型NDV F蛋白与野生型F蛋白的转移载体质粒,分别命名为 pT-sgA-eGFP-SV40-Fopt 和 pT-sgA-eGFP-SV40-Fwt,其中pT-sgA-eGFP-SV40-Fopt 质粒的 F 蛋白表达水平远高于 pT-sgA-eGFP-SV40-Fwt 质粒,将pT-sgA-eGFP-SV40-Fopt质粒和CRISPR/Cas9基因编辑质粒于CEF细胞中共转染,利用CRISPR/Cas9系统的NHEJ修复途径将优化的基因Ⅶ型NDV F基因表达盒和eGFP表达盒插入HVTFc126疫苗株的US2区,构建了名为rHVT-eGFP-Fopt的重组病毒。对编辑成功的重组病毒进行挑斑纯化,并将纯化后的rHVT-eGFP-Fopt进行PCR和IFA鉴定,结果显示F蛋白在重组病毒中正确表达。接下来通过Cre/LoxP重组酶系统将eGFP表达盒敲除,PCR和IFA鉴定结果显示成功得到一株名为rHVT-Fopt的重组病毒。对该重组病毒进行体外遗传稳定性和复制动力学的测定,该病毒成功在CEF中连续传代15代,F蛋白稳定表达,且复制速率与野生型HVT病毒相当。2.重组病毒rHVT-Fopt的免疫效力初步评价新城疫疫苗接种需要实现三个主要目标:防止病毒感染、降低发病率和死亡率以及减少病毒在鸡群中的传播和散播。为了研究rHVT-Fopt疫苗对NDV的保护效力,将该疫苗免疫1日龄SPF鸡,通过商品化NDV ELISA抗体试剂盒检测免疫后鸡群的血清抗体水平。在免疫后28天使用NDVF48E8强毒株进行攻毒,连续观察14天后统计发病率和死亡率,并于特定时间点采集咽拭子与泄殖腔拭子检测排毒情况。综合以上实验数据评价该重组病毒是否可以作为针对鸡新城疫的候选疫苗株。结果表明rHVT-Fopt 重组病毒在鸡体内能够产生 良好的体液免疫应答,所有接种疫苗的鸡在接受 NDV F48E8强毒攻毒后14天观察期内均未出现临床症状和死亡情况,也未检测到排毒,rHVT-Fopt对新城疫强毒的保护率为100%,证明rHVT-Fopt可以作为预防新城疫的候选疫苗。3.共表达NDV F蛋白和nVarIBDV VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建为了研发防控IBDV新型变异株的有效疫苗,并同时防控新城疫,本研究在之前构建的rHVT-Fopt的基础上,利用类似的方法将nVarIBDV/SN1905-2株的VP2基因表达盒插入rHVT-Fopt重组病毒的US2区,构建共表达基因Ⅶ型NDV F蛋白和nVarIBDV VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒,并且对成功获得的重组病毒进行生物学特性鉴定。结果表明,成功获得两株正确的共表达基因Ⅶ型NDV F蛋白和nVarIBDV VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒,分别命名为rHVT-Fopt-VP2-4与rHVT-Fopt-VP2-12。两株重组病毒的F蛋白与VP2蛋白均可以稳定表达,并且都具有同时防控ND与IBD的潜力。