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背景与目的食管癌是世界上癌症相关死亡的第六大常见原因。在发展中国家包括我国,食管癌的主要组织学类型是食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)。一般而言,在大多数ESCC病例中,该病在诊断时处于晚期阶段。即使在ESCC早期阶段,20%的患者在根治性食管切除术后也会复发。由于各种因素,包括耐受性、患者的一般状况、肿瘤分期和治疗费用等,治疗性手术、化疗和放疗对ESCC的作用有限。迄今为止,尽管有各种各样的ESCC治疗方案,但ESCC的预后不良仍然是临床医学的挑战。因此,非常需要开发更有效的ESCC治疗方法。随着科学的进步,许多学者提出来肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)学说,干细胞层面的研究越来越受到大家的重视,早在1996年Margaret A.Goodell使用荧光染料Hoechst 33342活染骨髓细胞后进行流式分析,得到一群游离于主群之外的双阴性的细胞群,称之为侧群(side population,SP)细胞,这一特殊的细胞群具有高致瘤性,自我更新,多向分化和耐药性的潜力,与CSC非常相似。因此SP分选则成为肿瘤干细胞的鉴定方式之一,为进一步研究肿瘤干细胞的生物学功能和分子机制奠定了基础。在过去的50多年中,二甲双胍(Metformin,Metf)已被广泛用于治疗2型糖尿病,经证明并不降低正常人的血糖。近年来,Metf的抗肿瘤作用越来越受到广泛的重视,目前,Metf对食管癌CSCs的作用及机制仍不清楚,尚需进一步研究,本文旨在研究二甲双胍对食管鳞癌SP细胞干性的作用及机制。方法1.通过流式细胞仪检测食管鳞癌细胞系的SP比例;2.综合细胞培养情况及SP比例,选取KYSE150进行细胞分选;3.CCK8法、平板克隆及成球实验检测二甲双胍对SP细胞体外增殖的影响;4.以Western blot法检测二甲双胍对SP细胞相关干细胞基因蛋白表达的影响、二甲双胍对SP细胞凋亡及周期相关蛋白的影响以及二甲双胍对SP细胞PI3K/Akt和Stat3信号转导通路的影响5.将未经二甲双胍处理以及二甲双胍处理后的SP、NSP细胞分别接种于裸鼠双侧腋窝皮下,建立皮下移植瘤模型,30天后对比不同组别移植瘤成瘤和增殖情况。6.用SPSS21.0统计软件进行实验数据分析。两个独立样本之间使用Student t检验,绘制图表使用GraphPad Prism 5.0软件。P<0.05被认为具有统计学意义。结果1.本实验共检测9种ESCC细胞系的SP比例,在0.2%~2%左右,且不同细胞系的SP比例略有不同。2.KYSE150细胞通过不同浓度的二甲双胍处理24h后,0mmol/L组SP比例为(1.54±0.45)%,5mmol/L组SP比例为(1.02±0.39)%,10mmol/L组SP比例降为(0.53±0.32)%,差异均具有统计学意义(P<0.05)。3.分选后的SP细胞给予不同浓度二甲双胍作用24h或48h后,细胞增殖受到显著抑制,细胞增殖抑制程度与二甲双胍浓度和给药时间显著正相关。4.平板克隆实验:未有二甲双胍处理后的SP细胞平均克隆数目为(122.2±10.31)个,NSP细胞平均克隆为(51.4±4.58)个,而5mmol/L二甲双胍组处理的SP以及NSP组均未见克隆长出,差异有统计学意义(P<0.01)。5.成球实验:SP细胞中0mmol/L二甲双胍组成球数目为(34.00±3.06)个,5mmol/L二甲双胍组成球数目为(12.67±2.03)个。NSP细胞中0mmol/L二甲双胍组成球数目为(13.00±1.53)个,5mmol/L二甲双胍组成球数目为(4.33±0.88)个,差异均有统计学意义(P<0.01)。6.不同浓度二甲双胍处理分选后的SP细胞24h后,提取总蛋白,发现细胞中BMI1、SOX2以及OCT4等干细胞相关基因蛋白的表达均有不同程度的降低。7.分选后用不同浓度的二甲双胍处理24小时后,细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平显著低于对照组,而促凋亡蛋白Bax的表达水平没有显著变化,导致促进/抗凋亡蛋白比例增高。8.用不同浓度的二甲双胍处理分选的SP细胞24h后,p-Stat3和p-Akt的表达被显著抑制,而细胞中Akt的表达没有显著变化。9.裸鼠成瘤实验:SP组较SP+Met组成瘤较多且体积较大,差异具有统计学意义(P<0.01)。NSP组较NSP+Met组成瘤较多且体积较大,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论1.二甲双胍可以在一定程度上降低KYSE150细胞系的SP比例,抑制分选的SP细胞的增殖、平板克隆形成、成球实验等,并能够降低BMI1、SOX2、OCT4等干细胞相关基因的表达,并且其降低程度与二甲双胍浓度呈正相关,因此可以得知,二甲双胍能够在一定程度上降低食管癌细胞的干性。Western Blot还证明二甲双胍可能通过下调Bcl-2和cyclin D1的表达而引起SP细胞凋亡和细胞周期停滞。二甲双胍还可通过PI3K/Akt和Stat3信号通路抑制食管癌SP细胞的增殖。裸鼠成瘤实验证明二甲双胍可以抑制SP细胞成瘤能力。2.二甲双胍能够杀伤肿瘤干细胞,在一定程度上降低肿瘤干细胞的比例,这可能为降低患者的复发转移率做出贡献,为食管癌患者提供一个更有价值的辅助治疗方法,延长患者的生存期。