水牛是重要的肉役两用家畜,人们对水牛性状的改良一直都在研究。CRISPR/Cas9技术的发展让快速、高效地改良水牛性状成为可能。研究表明MSTN(肌肉生长抑制素)基因对骨骼肌生长有调控作用。本研究在CRISPR/Cas9系统基础上设计了一种电穿孔工具和多条规则性gRNA,结合电穿孔技术将Cas9蛋白和多条规则性gRNA导入水牛受精卵对MSTN基因进行敲除。研究结果具体如下:1.水牛受精卵电穿孔参数的确定通过电穿孔技术将EGFP mRNA导入水牛受精卵,根据受精卵荧光阳性率和随后胚胎的发育情况探讨最佳电穿孔参数。当脉冲时间(2ms)、脉冲次数(3次)、脉冲时间间隔(0.2s)一定时,脉冲电压为30V组胚胎的囊胚发育率均显著高于40V和50V组,胚胎荧光阳性率低于40V组但高于50V组(P<0.05)。当脉冲电压(30v)、脉冲次数(4次)、脉冲时间间隔(0.2s)一定时,脉冲时间为4ms组的胚胎荧光阳性率显著高于2ms组(P<0.05),但囊胚率差异不显著(P>0.05);当电脉冲时间为6ms时对受精卵损伤较大。当脉冲电压(30v)、脉冲时间(4ms)、脉冲时间间隔(0.2s)一定时,脉冲次数为4次组的囊胚率与3次的差异不显著(P>0.05),但荧光阳性率比3次组的高(p<0.05)。当脉冲电压(30v)、脉冲时间(4ms)、脉冲次数(4次)一定时,脉冲时间间隔为0.2s组的囊胚发育率显著高于0.3s组(p<0.05),且其胚胎的荧光阳性率显著高于0.1s和0.3s组(p<0.05)。2.CRISPR/Cas9系统有效gRNA的筛选以水牛MSTN基因第三个外显子CDS序列为模板,相邻间隔10-200bp设计5条gRNA,同时构建相应的5条RGS报告载体。将cas9、gRNA表达载体、RGS报告载体共转染293T细胞,通过荧光观察和流式细胞仪分析筛选出了三条活性最高的gRNA,编辑效率分别为gRNA137.4%、gRNA236.30%,gRNA3 37.1%。将筛选的三条gRNAs同cas9载体共转染水牛胎儿成纤维细胞(BFF),结果显示三条gRNA都有内源活性。3.电穿孔导入CRISPR/Cas9系统敲除水牛受精卵MSTN基因通过将gRNA、cas9蛋白和电转液混合,用最优电穿孔参数对水牛受精卵施加电脉冲。本研究比较了单条gRNA和多条gRNA混合的效果,结果发现单条gRNA只在PAM位点附近引起了小片段删除,而混合3条gRNA时出现了 69bp的碱基片段删除,且3条gRNA编辑的效率比单条gRNA高。以上研究结果表明,水牛受精卵适合的电穿孔参数值为:脉冲电压30V、脉冲次数4次,脉冲时间4ms、每次间隔时间0.2s;利用电穿孔技术能够将CRISPR/Cas9系统组件高效导入水牛受精卵中,结合多条规则性gRNA,可以对靶基因MSTN进行大片段敲除。