PINK1蛋白相互作用蛋白的筛选与鉴定

来源 :中南大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:senfa88
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见于老年人的神经退行性疾病。目前其发病机制尚不清楚,但是众多研究显示,线粒体功能障碍在PD发病机制中起了重要作用:线粒体毒素(如MPTP)可以在人类或动物模型引起PD样表现;PD患者的线粒体功能障碍常见;PD致病基因之一的编码产物PINK1蛋白在线粒体上发挥其生物学功能。研究显示,PINK1蛋白定位于线粒体,对线粒体具有保护功能。了解PINK1蛋白的功能对于理解PD的发病机制以及治疗具有重要意义。虽然已经对PINK1蛋白的功能进行了许多研究,目前对其如何发挥保护线粒体功能并不清楚。许多蛋白质通过相互作用参与生物学过程而发挥其功能,因此寻找PINK1蛋白的相互作用蛋白是理解PINK1蛋白功能的一个重要途径。为了寻找可能与PINK1蛋白存在相互作用的蛋白,我们从如下5个方面进行了研究:1.首先应用基因重组技术,以本研究小组前期工作中构建的pcDNA3.1-PINK1为模板,成功构建了野生型PINK1蛋白酵母表达质粒pGBKT7-PINK1。经测序证实PINK1基因阅读框正确,载体构建正确。然后将pGBKT7-PINK1转化到酵母细胞AH109中,应用Western blot技术,检测PINK1蛋白在酵母菌株AH109中的表达情况。结果发现PINK1蛋白能够在酵母菌株AH109中正确表达。2.将27μl MATCHMAKER Human Fetal Brain GAL4 cDNA &genomic libraries原始菌液铺到300个150mm皿中,在30℃温箱中培养24-36小时至菌落融合,刮取菌落,共收集菌液1000ml。使用QIAGEN Tip2500试剂盒抽提1000ml菌液的cDNA质粒,共获得2.593mg文库cDNA质粒。3.采用大规模酵母质粒转化技术,将所抽提的cDNA文库质粒转化至酵母细胞AH109/pGBKT7-PINK1,进行人胎脑cDNA文库筛选。按照文库说明书要求,共进行了4次文库筛选,共筛选了6.65×10~6个克隆,筛选得到77个His~+克隆,继续进行Ade~+/Mell~+表型检测,我们总共获得了61个Ade~+/His~+/Mell~+克隆。4.61个Ade~+/His~+/Mell~+克隆经过划线、PCR及酶谱分析消除重复克隆,我们获得了49个Ade~+/His~+/Mell~+克隆。通过自激活验证消除能够自激活的克隆,最终我们筛选获得了2个真阳性克隆。经过测序和在NCBI数据库中进行BLAST,这两个真阳性克隆都是已知的蛋白质,它们是KIF1A(kinesin family member 1A)和BAG5(BCL2-associated athanogene 5)。这说明PINK1蛋白可能与KIF1A和BAG5分别存在相互作用。5.由于我们获得的KIF1A序列位于其mRNA的不翻译区,因此认为KIF1A不能作为PINK1蛋白互作蛋白的候选蛋白。而我们筛选到的BAG5序列位于其氨基端编码区,故继续进行了BAG5与PINK1蛋白是否存在互作的验证。收集HEK293A细胞中过表达的HA-PINK1蛋白,与JM109表达的GST-BAG5相孵育,在G4B(Glutathione 4 B)匀浆中进行pull down结合实验,Western blot中应用抗HA抗体作免疫印迹,结果发现在Input及HA-PINK1+GST-BAG5中均见一条63kDa大小的全长型和一条52kDa大小的成熟型PINK1条带;将PKH3-HA-PINK1和pEGFP-N3-BAG5质粒共转染HEK293A细胞,用抗GFP抗体免疫沉淀BAG5蛋白,分别用抗HA抗体和抗GFP抗体做免疫印迹,结果发现在经抗GFP抗体沉淀的蛋白复合物中检测到GFP和GFP-BAG5蛋白,说明免疫沉淀成功;用抗HA抗体做免疫印迹,结果发现共转染细胞组中存在一条63kDa大小的全长型PINK1条带及一条52kDa大小的成熟型PINK1条带。这些结果说明PINK1蛋白与BAG5在细胞体内、外均存在相互作用。继续进行体外结合实验证实PINK1蛋白与BAG5之间的相互作用是直接相互作用。我们首次采用酵母双杂交技术筛选PINK1蛋白的相互作用蛋白,首次发现PINK1蛋白可能与BAG5和KIF1A分别存在相互作用,首次证实PINK1蛋白与BAG5存在直接相互作用。本研究结果不但为进一步深入研究PINK1基因的功能奠定了基础,而且对于我们理解PINK1基因在PD发病机制中的作用、PD的治疗药物的开发以及线粒体功能障碍与PD的关系,甚至是线粒体与衰老的关系均具有重要意义。
其他文献
管理路桥工程的重点在于管理路桥的机械设备,从而实现建设路桥工程的目标,加强管理机械设备的力度,可以消除机械设备潜在的隐患,有效提高机械设备的使用效率。管理路桥施工设
回 回 产卜爹仇贱回——回 日E回。”。回祖 一回“。回干 肉果幻中 N_。NH lP7-ewwe--一”$ MN。W;- __._——————》 砧叫]们羽 制作:陈恬’#陈川个美食 Back to yield
社区成员自发合作供给是解决城市社区集体物品供给困境的可能路径,但合作供给模式的发育面临个体认知调整及内部制度环境的约束。以南京市42个住宅小区公用电梯的维保更新为
从本期开始,《党建》杂志、党建网、党建网微平台同时推出"学习五中全会精神"每月有奖竞答活动。设一等奖10名,各200元;二等奖100名,各100元;三等奖300名,各50元;优秀奖若干
在桥梁工程中,选用支架的结构时一般会根据桥梁上部的荷载力、桥梁底部的水文、地基状况来决定。分析桥梁上部结构支架现浇施工工艺,桥梁上部结构支架现浇施工技术的注意事项
回 回 产卜爹仇贱回——回 日E回。”。回祖 一回“。回干 肉果幻中 N_。NH lP7-ewwe--一”$ MN。W;- __._——————》 砧叫]们羽 制作:陈恬’#陈川个美食 Back to yield
【背景】脑血管病是当前严重危害人类生命和健康的常见病之一,其发病之快、恢复之慢、死亡之多、致残之重,给人们带来巨大的身心痛苦和经济损失。脑血管病一般分为出血性脑血
目的:系统评价贝伐单抗不同给药方式治疗恶性胸腔积液的有效性和安全性,为临床合理用药提供循证参考。方法:计算机检索Cochrane图书馆、PubMed、Embase、维普电子期刊全文数