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目的方法创伤性颅脑损伤(Traumatic Brain Injury,TBI)所致的主要病理改变包括神经损伤、颅内出血和血脑屏障(Blood-Brain Barrier,BBB)破坏。这些病理改变相互作用引起继发性脑损伤,其中继发性BBB破坏所引起的神经损伤、脑水肿甚至脑疝后果严重。因此,改善继发性BBB损伤对于减轻TBI后的病理变化和改善其预后有很重要的临床和科研意义。课题组前期研究发现,小鼠TBI后小胶质细胞外泌体中miR-124-3p升高最为显著,能够通过直接靶向PDE4B抑制mTOR信号的活性,从而抑制神经炎症的发展。并且有研究表明,自噬对血管内皮细胞活性发挥重要作用。基于以上研究成果,我们拟建立TBI体外模型,应用转染,离子电导显微镜等技术,通过调控脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMVECs)内miR-124-3p的表达,观察其通过调控自噬对细胞凋亡及紧密连接蛋白变化的影响,进而探讨其对BBB的影响及其机制,从而为miR-124-3p治疗创伤性脑损伤的新策略提供理论基础。方法1.将体外培养的b End.3细胞分为五个实验组:正常细胞组(Control)、划痕损伤处理组(Injury)、划痕损伤+miR-124-3p mimics处理组(I+miR-124-3p)、划痕损伤+阴性对照组(I+Negative Control)、划痕损伤+miR-124-3p mimics+氯喹处理组(I+miR-124-3p+CQ)。通过细胞转染技术将miR-124-3p mimics转染到b End.3细胞中,采用免疫荧光染色、RT-PCR检测转染效率。2.通过内皮细胞CD31+TUNEL荧光双标染色测定BMVECs凋亡情况,利用Western Blot检测紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的表达的变化、离子电导显微镜观察紧密连接生长情况,探讨miR-124-3p对BMVECs存活及BBB的影响。3.利用Western Blot检测TBI模型中自噬相关蛋白LC3-II/I、Beclin1、p62表达的变化,探讨在TBI模型中miR-124-3p的差异表达对BMVECs自噬功能的影响。4.使用CD31+TUNEL荧光双标染色检测划痕损伤+miR-124-3p mimics处理组(I+miR-124-3p)、划痕损伤+miR-124-3p mimics+氯喹处理组(I+miR-124-3p+CQ)BMVECs凋亡,探讨在TBI模型中自噬对BMVECs凋亡的影响。5.通过Western Blot,检测mTOR信号通路相关蛋白mTOR、PDE4B的变化,以探讨在TBI模型中miR-124-3p的差异表达对mTOR信号通路的影响。结果1.高表达miR-124-3p抑制TBI诱导的BMVECs凋亡。2.高表达miR-124-3p可以减轻TBI诱导的BBB损伤。3.miR-124-3p通过激活TBI后BMVECs自噬发挥保护BBB的作用。4.miR-124-3p通过抑制mTOR信号活性促进BMVECs自噬。结论通过上调BMVECs内miR-124-3p表达量可以抑制体外TBI模型中损伤细胞的凋亡,进一步研究发现,miR-124-3p是通过减少PDE4B的表达抑制mTOR信号通路来促进BMVECs自噬,从而对创伤性脑损伤后受损的BBB发挥保护作用。因此,miR-124-3p可能成为干预脑外伤后继发性BBB损伤的潜在治疗靶点,从而为miR-124-3p治疗TBI的新策略提供理论基础。