目的:前列腺癌(PCa)是男性癌症最常见的恶性肿瘤之一。对于晚期患者除了手术治疗以外,常常使用抗雄药物作为辅助治疗。这些抗雄药物多是靶向于雄激素受体(AR),竞争性地与雄激素结合在活性位点,阻碍AR信号通路并且抑制前列腺癌细胞的生长,但这些药物的治疗效果却未令人满意。随着结构生物学的发展,肿瘤的药物开发越来越多依赖关键靶蛋白的结构,成为肿瘤药物开发的主要方法。有研究报道在前列腺癌细胞中,FKBP51是AR的正调控因子,通过抑制FKBP51的活性能够有效抑制AR的转录活性,降低AR的信号通路。本课题以FKBP51为主要靶点,通过虚拟方法筛选方法,筛选出小分子抑制剂,抑制PCa细胞的生长。同时,前人报道小分子-对硝基酚(环境内分泌干扰物)具有抗雄活性,它的抗雄机制是复杂的,可能涉及了AR信号通路多个成分,但它是怎样抑制AR活性的并不知道。另外,雷帕霉素(rapamycin)是FKBP51已知的小分子抑制剂,但它对AR信号通路的影响是未知的,因此,我们研究是否它对AR信号通路的作用,以及是否通过FKBP51蛋白介导。本实验将FKBP51作为筛药的靶向蛋白和分子抗雄作用的关键蛋白,旨在研究FKBP51在前列腺癌信号通路中的作用,并进一步探讨小分子药物或者污染物通过FKBP51作用的可能的抗雄机制,为PCa及CRPC的治疗提供一种新的治疗策略,尤其对于雄激素抵抗型前列腺癌的药物设计及临床治疗提供了一定的理论基础和实验依据。方法:计算机虚拟筛选靶向FKBP51的小分子抑制剂,根据打分选择前140名的虚拟筛选小分子抑制剂;构建FK1-PET-28a质粒,通过大肠杆菌诱导表达并纯化FKBP51的FK1区域;通过蛋白质荧光淬灭实验-酶标法高通量检测蛋白质与虚拟筛选小分子的相互作用,并用荧光滴定法测结合较好的小分子的结合常数。不同温度下通过蛋白质荧光淬灭实验-分光光度法检测小分子(对硝基酚、rapamycin)与FKBP51的相互作用;将小分子与蛋白质共结晶,通过分子结构学方法X-晶体衍射分析小分子与蛋白质结合复合物的结构,分析它们结合的特征等;通过分子动力学方法检测分子小分子与蛋白结合的复合物的稳定性;采用MTT比色法检测小分子对前列腺细胞生长与增殖的影响;利用qRT-PCR检测小分子对AR所调控的下游基因mRNA水平的影响;通过Western blot检测小分子对AR、FKBP51与PSA蛋白的表达水平的影响。结果:(1)诱导和纯化FK1区域,纯化后鉴定纯度超过99%。(2)对硝基酚(PNP)能够与FKBP51的FK1区域相互作用,随着PNP滴定浓度的增加,蛋白的荧光强度减弱;随着温度的增加,它们的结合增强,在人体生理温度下(310k)它们的结合力最强。(3)X-晶体衍射分析FK1与PNP结合的复合物的结构,PNP占据了FK1区域的活性位点,与未结合小分子的蛋白相比,复合物结构更加坚固。(4)分子动力学揭示了FK1与PNP的结合非常稳定。(5)计算FK1区域与PNP的结合自由能得出小分子与蛋白主要通过非极性键相互作用。(6)计算与PNP结合的FK1区域的每个热点氨基酸的结合自由能,显示出与X-晶体衍射结构分析一致的热点氨基酸。(7)不同浓度的PNP在48小时抑制了前列腺癌LNCaP和22Rv1细胞的生长与增殖。(8)PNP抑制了AR所调控的下游基因(PSA,KLK2,S100P,TMPRSS2)的mRNA水平的表达,从而抑制了AR信号通路。(9)计算机虚拟筛选得到FKBP51小分子抑制剂,前140名能够与FKBP51蛋白相互作用。(10)得到结合较强的前10个虚拟筛选小分子的解离常数,其中四个小分子的Kd值小于20μM。(11)虚拟筛选小分子能够抑制LNCaP细胞的生长和增殖。(12)不同浓度的Rapamycin在24小时和48小时抑制了前列腺癌LNCaP细胞和22rv1细胞生长。(13)Rapamycin能够与FKBP51相互作用。(14)X-晶体衍射分析FK1与rapamycin结合的复合物的结构,rapamycin占据了FK1区域的活性口袋结构。(14)Rapamycin能够抑制AR调控的下游基因mRNA的表达。(5)Rapamycin抑制了AR调控的下游基因PSA蛋白水平的表达。结论:本实验发现了PNP能够与FKBP51蛋白结合及PNP在前列腺癌细胞的抗雄机理,即PNP抑制AR的信号通路可能通过与FKBP51相互作用,抑制其活性进而抑制了AR的活性,降低AR下游基因的表达,抑制前列腺癌细胞的生长。另外,我们运用虚拟筛选方法,以FKBP51为靶点,得到了一些有效抑制前列腺癌细胞生长的小分子,并且在分子水平上验证了与FKBP51的相互作用。同时,作为FKBP51的抑制剂rapamycin,我们通过X-晶体衍射揭示了rapamycin与FKBP51的结合方式,同时证明了rapamycin能够降低AR的信号通路,抑制前列腺癌细胞的生长。