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本文结合细胞生物学，分子生物学、生物化学、生物信息学等理论和技术手段，从细胞和分子水平系统研究印楝素（Azadirachtin，AZA）诱导Sf9细胞凋亡过程中溶酶体组织蛋白酶Cathepsin B(SCB)和Cathepsin L(SCL)的调控作用，初步阐明了SCL在AZA诱导Sf9细胞凋亡信号通路中的作用。主要结果如下：
(1) AZA(0.75μg/mL)能够干扰细胞正常分裂，引起细胞在G2/M停滞，导致细胞凋亡，最终抑制Sf9细胞增殖生长。此外，Sf9细胞凋亡过程中胞内溶酶体数量和体积随着诱导时相的延长而逐渐增多增大，溶酶体类型也逐渐多样化。
(2)形态学分析显示SCL活性抑制剂Z-FF-FMK(FF)和凋亡抑制剂Z-VAD-FMK(VAD)均能有效抑制AZA诱导的Sf9细胞凋亡，初步证明SCL能够促进AZA诱导的Sf9细胞凋亡。另外，FF和VAD均能抑制Sf9细胞凋亡过程中胞内溶酶体的增加，表明溶酶体变化是AZA诱导Sf9细胞凋亡的必要生理活动。同等条件下，SCB抑制剂CA-074me(CA)不能抑制Sf9细胞凋亡，初步表明SCB未参与AZA诱导的Sf9细胞凋亡。
(3)研究中克隆了Sf9细胞SCB和SCL基因ORF序列。SCB和SCL基因ORF分别为1026和1035bp，编码341和344个氨基酸；两个基因的编码区均没有内含子。SCB和SCL的N端前分别含有20和16个氨基酸的信号肽序列，成熟蛋白分别含有321和327个氨基酸，两者均属于亲水性蛋白。SCB和SCL ORF的cDNA序列已登录GenBank，登录号分别为HQ110064和HQ110065。
(4)研究中构建了表达载体pET-28a(+)-SCB和pET-28a(+)-SCL，利用大肠杆菌表达系统对SCB和SCL进行诱导表达。蛋白表达检测结果显示，重组的SCB和SCL蛋白均获得高效表达，蛋白主要以包涵体形式存在。溶解包涵体蛋白后，通过电洗脱法纯化回收蛋白。利用纯化的重组SCL蛋白免疫兔子制备多克隆抗体，ELISA检测结果显示所制备多克隆抗体具有较高的效价。
(5)Semi-RT-PCR和QRT-PCR分析结果显示AZA诱导Sf9细胞凋亡过程中SCL与凋亡执行基因Caspase-3mRNA表达量呈现协同变化：AZA诱导12、24、36h表达量较对照显著上升，其中Caspase-3mRNA表达量在12h大幅度升高。FF干预下，Caspase-3mRNA表达量在36h内显著下降，之后出现回升，表明FF抑制AZA诱Sf9细胞凋亡具有有限性。而VAD干预下，AZA诱导Sf9细胞SCLmRNA表达量显著降低。SCL可能介导一种上游信号通路激活Caspase-3介导的下游凋亡信号通路参与AZA诱导的Sf9细胞凋亡。SCBmRNA表达量在Sf9细胞凋亡过程中未见明显变化，表明其没有参与AZA诱导的Sf9细胞凋亡。FF抑制AZA诱Sf9细胞凋亡具有有限性表明除SCL介导的上游信号通路外，还存在其他上游信号通路激活同样的凋亡下游信号通路，引起Sf9细胞凋亡。
(6)Western blot分析结果显示AZA诱导Sf9细胞12、24、36、48h，Caspase-3和SCL蛋白表达量明显增加，诱导24h后，Caspase-3酶原剪切形成20KD左右的小蛋白，酶原被明显激活，并随诱导时间增加活性逐渐增加，诱导12h，未检测到该小蛋白，Caspase-3未被明显激活。利用VAD抑制细胞凋亡能够降低SCL在翻译水平的表达，而抑制SCL活性能明显抑制Caspase-3的活化，从翻译水平进一步表明SCL通过激活Caspase-3介导的下游凋亡信号通路参与AZA诱导的Sf9细胞凋亡。另外，AZA诱导Sf9细胞12h，Caspase-3mRNA表达量己大幅度升高，此时未检测到活化形式的Caspase-3，证明AZA通过Caspase信号通路诱导Sf9细胞凋亡有着时序性，首先激活Caspase-3基因，促进其在转录水平和翻译水平的表达，提高胞内Caspase-3原酶量，然后剪切原酶，提高激活型Caspase-3酶量，最终引发细胞凋亡。结合形态学和mRNA表达分析表明Caspase-3可能不是该凋亡通路中唯一的执行蛋白，而且除Caspase介导的凋亡信号通路外，可能有其他细胞凋亡信号通路参与AZA诱导的Sf9细胞凋亡。
(7)同源建模获得SCB和SCL的三维结构模型，SCB折叠形成紧密的球状结构，含有6个二硫键。SCB活性位点含有ARG19、VAL23、ASN243个关键氨基酸，结合口袋比较浅，形状不规则、袋口较宽。CA分别与SCB活性位点的VAL23和ASN24形成两个氢键。SCL折叠形成“元宝”状结构，含有3个二硫键。SCL活性位点含有LYS94、GLN227、SER93、LYS804个关键氨基酸，结合口袋比较深，呈S凹槽型，袋口比较窄。FF分别与SCL活性位点的SER93、SER321形成两个氢键。
本文通过研究溶酶体组织蛋白酶SCB和SCL在AZA诱导Sf9细胞凋亡中的调控作用，为深入研究AZA杀虫机理提供新的理论基础，也为探求以昆虫组织蛋白酶为靶标蛋白的新农药研究和开发提供新的思路。同时研究初步证实Sf9细胞凋亡中存在溶酶体信号通路，为昆虫细胞信号转导通路研究添加新的内容。