表面活性剂是一类最重要的精细化工产品,广泛应用于家庭、工业和农业。人们的日常生活工作的每一个方面基本上都与表面活性剂密切相关。与化学表面活性剂会一定程度上破坏环境不同,生物表面活性剂对环境无污染,因此生物表面活性剂替代化学表面活性剂成为必然趋势。槐糖脂是产量最高的一类生物表面活性剂,由于其具有低毒性、良好的生物活性、表面活性和环境兼容性等诸多优点,可应用于石油、环境保护、日化、医药等工业领域,尤其是在石油工业的应用日益引起研究者的关注。因此,槐糖脂被认为是一种最有发展潜力和应用前景的可再生的生物表面活性剂,对其进行深入研究及应用开发将会带来巨大的社会效益、经济效益和生态效益。本论文的主要研究内容及结果如下:1.拟威克酵母控制槐糖脂分泌基因的初步研究目前,对槐糖脂的胞外分泌过程并不清楚。本论文通过对拟威克酵母(Wickerhamiella domercqiae var.sophorolipid CGMCC 1576)的基因组分析,认为ABCB1基因可能是控制槐糖脂分泌作用的基因。首先,构建了具有潮霉素作为筛选标记基因的敲除盒,对目的基因进行了的敲除,并对其功能进行了初步分析。ΔABCB1敲除株槐糖脂的产量较野生株大幅下降,表明该基因确实影响了槐糖脂的合成。然后,通过HPLC对胞内和胞外槐糖脂含量进行分析,发现ΔABCB1敲除株较野生株胞内槐糖脂含量更高,推测ABCB1基因未能阻断槐糖脂的合成通路,而是影响了槐糖脂的分泌。最后,使用荧光实时定量PCR分析了ΔABCB1敲除株中槐糖脂合成相关酶基因的表达情况,发现敲除株中槐糖脂合成关键酶基因表达量略有降低,推断ABCB1应该为槐糖脂分泌控制基因。2.利用棉籽糖蜜和棉籽油生产槐糖脂的研究生产成本较高是槐糖脂目前尚未大规模工业生产走向市场的主要原因。为降低成本,我们选择价格低廉的棉籽糖蜜和棉籽油作为底物进行槐糖脂生产相关研究。通过对亲水性源和疏水性碳源替换、氮源梯度设计、无机盐影响实验,发现利用仅以棉籽糖蜜和棉籽油做底物时,即可较好的生产槐糖脂,内酯型槐糖脂产量达到23.96 g/L。再通过单因子实验、和二因子响应面实验的进一步优化确定了最优发酵培养基配方,此时内酯型槐糖脂产量达到25.00 g/L以上,比使用葡萄糖油酸培养基时产量至少提高4.0%。经过对发酵产物的HPLC-MS分析,W.domercqiae利用廉价底物发酵得到的槐糖脂成分与使用葡萄糖油酸培养基时的产物成分基本相同。3.槐糖脂发酵的参数优化和中试生产探索目前,W.domercqiae菌株的发酵工艺优化尚未进行系统研究,我们对W.domercqiae菌株生产槐糖脂的发酵温度和搅拌转速进行优化,得到最适的发酵参数;并且在1.5 L发酵罐中考察了补加葡萄糖、补加油酸和控制pH对菌株生产槐糖脂能力的影响。根据优化结果,在7.5 L发酵罐中分别使用普通培养基和廉价培养基进行W.domercqiae扩大发酵,其内酯型槐糖脂产量分别达到33.10g/L和33.48 g/L。最后在车间内使用50 L发酵罐进行W.domrcqiae的中试生产,内酯型槐糖脂产量达到51.90 g/L,总槐糖脂产量超过100 g/L。因此,我们认为优化发酵参数后,W.domercqiae菌株可以适应工业大规模发酵。4.拟威克酵母在石油工业的应用探索首次研究槐糖脂产生菌——W.domercqiae在石油领域的应用价值。通过对拟威克酵母进行发酵,得到上层发酵液及内酯型槐糖脂溶液。以脂肽溶液作对照,测定三种溶液的表面张力、与原油的界面张力、乳化能力和粘度值,发现内酯型槐糖脂溶液作为驱油剂时,具有最好的理化性质。然后通过物理驱油模型,对不同驱油剂驱油效果进行考察,结果显示槐糖脂上层发酵液可以提高6.34%的石油采收率,3.0g/L的内酯型槐糖脂可以提高3.39%,且二者均有良好的抗稀释性。所以,拟威克酵母在石油工业微生物采油领域具有广阔的应用前景。