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新城疫(ND)是由副粘病毒科的新城疫病毒(NDV)引起的一种禽类致死性传染病,是危害我国畜牧业的A类疾病之一。F蛋白是新城疫病毒主要结构蛋白之一,是一种使病毒的包膜与宿主细胞的质膜相融合的融合蛋白；其功能主要是参与病毒的穿入、细胞的融合与溶血。同时F蛋白还是能诱导机体产生中和性抗体的抗原蛋白,其在机体免疫中也发挥重要作用。F基因能够表达F蛋白。因此,以F基因为目的基因,利用基因重组技术研制新型疫苗成为国内外关注与研究的热点。本研究首先以本实验室保存的质粒pMD-NDV-F的基因序列为参考序列,应用DNAstar分析软件设计了一对含有HA标记的特异性引物。然后通过PCR扩增出HA-F基因,并将其克隆到pMD18-T载体上；经限制性内切酶分析和核苷酸序列测定,证明获得了含有新城疫病毒F基因的阳性重组质粒并命名为pTYL-HA-F。利用限制性内切酶酶切技术和T4-连接酶连接技术将pTYL-HA-F中HA-F基因克隆于本实验室构建的真核表达表达质粒pLM, pLM-ITRs, pLM(-), pSD, pSD-ITRs, pSD(-)的多克隆位点下,获得重组转移质粒分别命名为pYL-LM, pYL-LM-ITRs, pYL-LM(-), pYL-SD, pYL-SD-ITRs, pYL-SD(-);并将重组转移质粒转化E.coli DH10bac感受态细胞,获得重组Bacmid,分别命名为bYL-LM, bYL-LM-ITRs, bYL-LM(-), bYL-SD, bYL-SD-ITRs, bYL-SD(-);再将重组杆状病毒穿梭载bYL-LM, bYL-LM-ITRs, bYL-LM(-), bYL-SD, bYL-SD-ITRs, bYL-SD(-)分别转染Sf9细胞获得P1代病毒储备并分别命名为vYL-LM, vYL-LM-ITRs, vYL-LM(-), vYL-SD, vYL-SD-ITRs, vYL-SD(-);进而通过病毒扩增分别获得相应P2,P3代病毒,其间利用空斑实验测定病毒效价,最终获得滴度达108pfu/ml以上的高效价病毒。在MOI=40,添加10mmol/ml丁酸盐的条件下,利用高效价病毒侵染中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1),培养72h后收取蛋白。利用SDS-PAGE与Western blot鉴定F蛋白是否表达并利用软件进行分析比较含不同启动子和调控元件下重组转移质粒表达F蛋白的抗原性的差异。挑选出表达抗原性最好的重组转移质粒,本实验可为制备鸡新城疫疫苗奠定坚实的基础。结果表明,六个重组转移质粒均可以表达F抗原。经过比较发现含CBA启动子的pYL-SD, pYL-SD-ITRs, pYL-SD(-)比含有CMV启动子pYL-LM, pYL-LM-ITRs, pYL-LM(-)有更强的表达F蛋白的能力,说明CBA启动子优于CMV启动子；通过两组pYL-LM与pYL-LM(-), pYL-SD与pYL-SD(-)表达F抗原的比较,发现pYL-SD, pYL-LM与对应的对照质粒pYL-SD(-), pYL-LM(-)相比有更强表达F蛋白的能力,证明添加调控元件WPRE后,能增加F蛋白表达量；对于元件ITRs的作用可以通过pYL-LM与pYL-LM-ITRs, pYL-SD与pYL-SD-ITRs比较获得,但是ITRs作用为延长表达时间,并文献报导最多可以延长表达90天,因此需要进行鸡体免疫实验才可以实现,由于条件限制,本研究尚未涉及。