目的通过添加卵泡刺激素对绵羊卵巢、胎儿卵巢进行冷冻和移植前的干预,探索可保存卵巢间质、保护卵泡储备的简便、经济、有效的冻存法;通过绵羊卵巢组织自体和异体不同移植部位的比较,筛选最佳的移植部位,为临床应用提供科学依据。方法①不同体积的绵羊卵巢皮质块超玻璃化冷冻的间质细胞形态学观察:将3～6月龄的绵羊卵巢皮质按体积的不同分为三组,40mm³:5mm×4mm×2mm;80mm³:10mm×4mm×2mm;160mm³:10mm×8mm×2mm大小的组织块,采用两步渗透平衡法摸索适宜于不同体积的绵羊卵巢组织的玻璃化冷冻的渗透平衡时间,并对解冻后的卵巢进行间质细胞的光镜及分离细胞存活率的观察。②FSH干预对绵羊卵巢组织玻璃化冻存后异种异位移植效果的观察:在冷冻液、解冻液、培养液中添加FSH,将绵羊卵巢组织冻融后行裸鼠颈部皮下移植,通过血清E2测定、移植存活的卵泡计数评价FSH对大皮质卵巢组织异种移植的作用。③绵羊卵巢组织玻璃化冻存后自体移植:对40mm³体积的成年绵羊卵巢皮质进行玻璃化冻存,解冻后采用原位和异位卵巢移植,进行绵羊卵巢组织新鲜及玻璃化冻存卵巢的自体移植,通过移植存活卵泡数评价卵巢组织大皮质块移植的适宜部位和观察玻璃化冻存的卵巢组织自体移植后的发育结果。④玻璃化冻存绵羊卵巢组织异体移植:对40mm³体积的成年绵羊卵巢皮质进行玻璃化冻存,解冻后采用异体原位和异位卵巢移植,通过血清FSH、E₂测定、移植存活卵泡数评价移植部位和观察玻璃化冻存的卵巢组织异体移植后的发育结果。⑤采用大皮质片最佳的玻璃化渗透平衡时间和FSH干预,进行胎儿卵巢组织大皮质片玻璃化冻存及培养。通过卵泡形态学观察、卵泡构成比和卵泡直径观察评价不同体积皮质片玻璃化冻存和FSH干预效果。结果①三种不同体积的卵巢皮质块在玻璃化冷冻液中经渗透平衡后,进行玻璃化冻存,组织学观察:A.间质细胞数量和形态变化:40mm³皮质块在玻璃化液渗透平衡不同时间下冷冻后,卵巢组织内基质细胞数量以渗透平衡7min组（16.00±2.16）与新鲜对照组（16.00±2.83）相似,5min、6min、8min组细胞数量较多,与新鲜对照组相比差异有统计学意义,P<0.05,卵巢组织内形态正常基质细胞百分率以渗透平衡7min组（79.50±6.95）和渗透平衡8min组（80.25±4.03）与新鲜对照组（88.00±3.56）相似,5min、6min组较低,与新鲜对照组相比,差异有统计学意义,P<0.05; 80mm³皮质块在不同渗透平衡时间下冷冻后,卵巢组织内基质细胞数量以渗透平衡11min组（20.050±2.38）、12min组（19.25±0.50）与新鲜对照组（18.00±2.45）相似,10min、13min组与新鲜对照组相比较多,差异有统计学意义,P<0.05,卵巢组织内形态正常基质细胞百分率除了渗透平衡11min组（84.00±0.81）与新鲜对照组（86.25±1.50）相似外,10min、12min、13min组与新鲜对照组相比较低,差异有统计学意义,P<0.05;160mm³皮质块在不同渗透平衡时间下冷冻后卵巢组织内基质细胞数量除渗透平衡19min组较低,17min、18min、20min组与新鲜对照组（18.50±1.73）相比较多,差异有统计学意义,P<0.05,以19min组（19.50±2.38）与新鲜对照组最接近;卵巢组织内形态正常基质细胞百分率以渗透平衡19min组（81.50±4.40）与新鲜对照组（85.25±4.99）相似外,其余各组与新鲜对照组相比较低,差异有统计学意义,P<0.05。B.绵羊卵巢组织冻存后基质细胞存活率:新鲜组及各冻融组基质细胞得数和存活率差异均无统计学意义,P>0.05。②FSH干预对绵羊卵巢组织玻璃化冻存后异种异位移植效果的观察:移植术后4w,FSH干预冻融移植组与新鲜移植组相比动情周期恢复率、每高倍视野卵泡计数差异均无统计学意义,P>0.05,高于非FSH干预的冻融移植组,P<0.05;动情周期恢复需要的天数接近于新鲜移植组,明显短于非FSH干预的冻融移植组,P<0.05。移植后4周,FSH干预冻融移植组组织学观察见卵泡发育,而非FSH干预的冻融移植组仅偶见原始卵泡。FSH干预冻融移植组与新鲜移植组相比血清E₂水平差异均无统计学意义,P>0.05;未添加FSH的玻璃化冻存移植对照组血清E₂水平低于FSH干预冻融移植组和新鲜移植组,P <0.05。③绵羊卵巢组织玻璃化冻存自体移植:与同体积新鲜取材卵巢正常卵泡数相比,新鲜原位移植6m取材见6.38%卵泡存活,冻融原位移植3m取材见5.74%卵泡存活,且都有发育的次级卵泡,新鲜及冻融异位移植均未见卵泡存活。④玻璃化冻存绵羊卵巢组织异体移植:血清FSH水平除新鲜异体原位移植组外,其他各组与空白对照组相比,差异有统计学意义,P<0.05;异体移植各组间相互比较,新鲜异体原位移植组与两异位移植组差异有统计学意义,P<0.05,与冻融异体原位移植组间差异无统计学意义;冻融异体原位移植组与两异位移植组和空白对照组间差别有统计学意义,P<0.05。血清E₂水平除新鲜异体原位移植组外,其余各组与空白对照组相比,差异有统计学意义,P<0.05,异体移植各组间相互比较,新鲜原位移植组与其他三组之间差异有统计学意义,P<0.05;冻融原位移植组与两异位移植组之间差异有统计学意义,P<0.05;两异位移植组之间差异无统计学意义。移植物卵泡存活率:移植术后3m,同期发情处理,冻融异体原位移植见6.79%～2.42%卵泡存活。新鲜和冻融异位移植均未见存活卵泡。新鲜异体原位移植出现发情反应,继续饲养观察。⑤采用大皮质片最佳的玻璃化渗透平衡时间和FSH干预,进行胎儿卵巢组织大皮质片玻璃化冻存及培养:A形态正常卵泡构成比:新鲜组与两个冻融组相比P>0.05,无统计学意义。两个不同体积的冻融组比较P>0.05,无统计学意义。同体积的冻融组和培养4.5h组之间相比较,卵泡呈现发育表现,卵泡构成比有统计学意义。B卵泡直径:新鲜组和两冻融组相似,P>0.05,差距无统计学意义。两冻融组间比较P>0.05无统计学意义。同体积的冻融组和培养组之间相比较,培养组卵泡直径增大,差别有统计学意义。结论①玻璃化法可有效冻存体积为40mm³、80mm³及160mm³绵羊卵巢组织大皮质块中的基质细胞,为移植后的卵泡发育提供了细胞基础。②玻璃化冷冻、解冻液和培养液中添加10μg/mL FSH,可提高冻存绵羊卵巢组织裸鼠体内异位移植的存活率,促进体外培养卵泡的发育。③绵羊卵巢组织大皮质片冻存后,正常卵泡数与新鲜组相似,玻璃化冻存后移植存活卵泡数与新鲜移植组接近,但均表现为大量的卵泡丢失。④适宜的玻璃化液渗透平衡时间可有效冻存人胎儿卵巢大皮质片,冻融过程的FSH添加并不影响早期卵泡的构成比,但是体外培养4.5h可使一定量的原始卵泡发育至早期初级卵泡阶段。