抗Luman募集因子N端蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

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LRF(Luman-recruiting factor)也称为Luman/CREB3/LZIP募集因子,是一种蛋白转录因子,属于碱性亮氨酸拉链(L-Zip)蛋白转录因子家族,LRF蛋白共有639个氨基酸(aa)残基,分子量为72ku,研究证明,LRF参与内质网应激中的未折叠蛋白反应,在特别的亚核区募集Luman,该亚核区抑制Luman的转活以及促进蛋白降解从而抑制Luman的作用。但是LRF在生理上的作用机制仍不清楚,因此本实验制备抗LRF单克隆抗体,为后续试验提供技术依据,试验结果如下:1、以pGEX-4T-1为骨架载体,插入LRF-N基因片段,构建了原核表达载体,命名为pGEX-LRF-N。2、优化原核表达GST-LRF-N重组蛋白的条件,试验表明:在37℃,0.1mmol/L的IPTG的终浓度、诱导5h时,重组蛋白的表达效果最好。并用亲和层析法纯化得到了GST-LRF-N重组蛋白。3、GST-LRF-N重组蛋白免疫的血清抗体效价均达到1:4×10~3以上。筛选出最佳的间接ELISA条件。4、用PEG融合剂融合,并用间接ELISA筛选阳性细胞孔,亚克隆后得到三株稳定分泌抗LRF-N蛋白McAb的细胞株(2AC9、2AG10和3G7)。5、2AC9、2AG10和3G7三株单克隆细胞株的细胞上清效价分别为:1:200、1:400、1:400,腹水效价均达到1:10~6;2AC9重链为IgG2a,2AG10重链为IgM,3G7重链为IgG1;亲和常数分别分别约为2×10~5、2×10~5、2×10~6。制备的单克隆抗体为研究LRF蛋白在细胞、组织中的表达,阐明LRF蛋白在机体中的作用机制奠定了基础。
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