β-淀粉酶（α-1,4-D-glucan maltohydrolase,EC3.2.1.2）,是一种外切型淀粉酶,当作用于直链淀粉时,主要生成β-麦芽糖、葡萄糖以及麦芽三糖,而作用于支链淀粉时,主要生成麦芽糖及极限糊精。β-淀粉酶在啤酒酿造、制糖等生产领域有广泛的应用,商品化的β-淀粉酶主要来源于植物,热稳定性、p H耐受性较好,但工艺复杂,成本较高,且酶质量不稳定、纯度不高,而微生物来源的β-淀粉酶专一性、经济成本低,更易达到规模化生产,因此受到研究学者的青睐。本论文通过β-淀粉酶基因重组克隆表达技术,筛选单启动子、构建双启动子提升调控基因表达的强度,并同义突变高度保守的碳分解代谢物响应元件（catabolite responsive element,CRE）区域,以阻止分解代谢物控制蛋白（catabolite control protein A,Ccp A）形成的复合物与其结合,缓解碳分解代谢物阻遏效应（carbon catabolite repression,CCR）,最后经过培养条件优化,β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中表达水平达到8616.1 U/m L。主要研究内容如下:（1）β-淀粉酶基因重组表达体系的构建:成功扩增Bacillus.megaterium DSM 319来源的β-淀粉酶基因Amy M与来源于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、解链淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的22个天然启动子连接,成功构建了22株由单一启动子介导β-淀粉酶表达的重组菌株,经过测定发酵上清液中β-淀粉酶酶活,结果显示由P₄₃、P_{amy Q}、P_{sig W}、P_{spov G}、P_{gsi B}、P_B.liche-apr、P_{npr B}启动子介导表达的β-淀粉酶酶活水平较高,进一步筛选了不同组合的双启动子,测定β-淀粉酶酶活水平,显示双启动子P₄₃-P₄₃组合介导的β-淀粉酶重组菌株,在摇瓶发酵培养条件下酶活最高为2950.8 U/m L。（2）重组β-淀粉酶的纯化及酶学性质研究:对重组菌株p BED01(P₄₃-P₄₃)摇瓶发酵,取发酵上清液进行镍柱亲和层析纯化,结果显示重组酶β-淀粉酶的比酶活为361.04 U/mg,回收率为17.29%,纯化倍数为3.04,SDS-PAGE电泳结果显示蛋白的分子量约为50 k Da,重组β-淀粉酶经酶学性质分析,显示重组β-淀粉酶最适温度为50℃,最适p H值为6.0,在温度为35～45℃以及p H在5.0～6.0范围内β-淀粉酶具有较好的稳定性,金属离子Co²⁺对重组β-淀粉酶酶活有明显的激活作用,Zn²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺、Ba²⁺随着浓度的变化,β-淀粉酶酶活力一直处于抑制状态,其中Ba²⁺的抑制效果最为明显。（3）缓解碳分解代谢阻遏效应:β-淀粉酶的基因中存在高保守的分解代谢物响应元件（catabolite responsive element,CRE）,并与反式阻遏蛋白—分解代谢物控制蛋白（catabolite control protein A,Ccp A）结合。定点突变CRE相应元件中的碱基,导致阻遏复合物无法与CRE位点结合,从而缓解碳分解代谢阻遏（Carbon catabolite repression,CCR）的影响。本研究结果显示,经过定点突变CRE位点的保守碱基,β-淀粉酶的酶活表达水平最高为4663.0 U/m L,相较于未突变前提高了58.0%。（4）高表达重组菌株p BE05发酵培养条件优化及应用:优化碳源为2.5%马铃薯淀粉,优化氮源为3%的酵母粉和胰蛋白胨复合氮源（2:1）,培养基初始p H为7.0,同时发酵摇瓶温度为34℃时,经发酵培养27 h时,取样测定上清液中重组β-淀粉酶的酶活水平达到最高8616.1 U/m L,相较未发酵优化前β-淀粉酶酶活提高了84.8%。将发酵产生的重组β-淀粉酶应用于糖化过程,探究重组β-淀粉酶加入量对麦芽糖转化率的影响,经研究发现当重组β-淀粉酶液的加入量为200 U/g时,麦芽糖的转化率达到了最高水平为57.6%,继续添加β-淀粉酶,麦芽糖转化率则不再提高。