戊型肝炎(Hepatitis E,HE)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)引起的急性病毒性疾病,该病属于人畜共患病,对人类健康具有很大的危害。戊型肝炎病毒属于肝炎病毒科(Hepeviridae Family)肝炎病毒属(Hepevirus),为单股正链RNA病毒,基因组全长约7.2kb,具有3个互相重叠的开放读码框架(Open reading frame,ORF),自病毒基因组的5′末端到3′末端依次排列着非编码区(UTR)、ORF1、ORF3和ORF2。3’端非编码区是由腺嘌呤核苷酸组成的多聚腺苷酸尾(polyA),其中ORF3与ORF1、ORF2部分重叠,或完全包含在ORF2中。ORF1为非结构区基因,主要编码非结构蛋白；ORF2编码病毒的衣壳蛋白；ORF3编码功能未知的蛋白。目前戊型肝炎尚无有效的治疗方法,唯一可行的是预防。因此,戊型肝炎疫苗的研制受到国内外学者的广泛关注。对于戊肝的防治至今尚无商品化疫苗,多种基于DNA重组技术的戊肝候选疫苗也处于研制阶段。HEV感染性cDNA克隆以及细胞感染模型的建立对戊肝抗病毒研究和减毒活疫苗研究将有很大的帮助。基于以上分析,本研究利用分子生物学和反向遗传学的技术和手段对本实验室自行分离得到的3型戊型肝炎病毒SAAS-JDY5株进行基因组全长cDNA克隆的构建。实验主要包括三个部分,首先用重叠延伸per (overlap per)的方法把实验室已有的9个包含了HEV SAAS-JDY5株全部基因组信息的片段连成4段；接下来结合In-fusion技术和以限制性内切酶、连接酶为基础的DNA重组技术把这4段连成基因组全长cDNA;最后为了保证全长cDNA克隆具有感染性,又用In-fusion技术对它进行了改造。Overlap per的原理：设计具有互补末端的引物,使PCR产物形成重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。本实验室已获得SAAS-JDY5株HEV的全基因组序列和9个包含了HEV全部基因组信息的片段,并且相邻的片段之间都有一段重复序列,符合了overlap per的条件,所以首先想到的是用overlap per法连接这9个小片段。以相邻的两段为模板,第一段的上游引物和第二段的下游引物为引物进行PCR扩增,就把两个片段连接起来,得到新的长片段。重复上述操作直到把9个小片段连成4个2kb左右的长片段(1～2474,2094～4664,4340～6645,5186-7232)。此方法在操作过程中需注意两个模板的浓度和比例,最好保证摩尔比为1比1,而且浓度不能太低；另外退火温度也需摸索,overlap per的退火过程中不仅仅有引物和模板的结合,还有两段模板之间重复序列的结合,是整个过程的关键,因此需要反复摸索直到确定一个最佳退火温度。由于是双模板,比普通PCR难度要大,片段太长不容易扩增出来,而且保真性也不好,所以只用这个方法连出大小为2kb左右的片段,后续的研究用传统的内切酶消化和连接酶处理以及In-fusion法。传统的以限制性内切酶和连接酶为基础的DNA重组技术曾经革命性地推动了分子生物学和遗传工程的发展,至今仍然发挥着重要作用。但是实验室原有的片段太多,找酶切位点比较困难。用overlap per连成4个长片段后就相对容易一些,利用4626位置上的KpnⅠ和载体上的XbaⅠ这两个酶切位点将中间两段连接,从而形成3个大片段(1～2474,2094～6645,5186～7232)。In-fusion法的原理跟基因同源重组类似,利用DNA片段的同源关系将目的片段定向地插入载体中。这个方法只需一个单一的酶切位点将载体线性化即可,不需要两个单一的酶切位点,条件没有前面苛刻,所以结合这个方法用于最后两步连接。先利用载体上的Xbal酶切位点将前两段连接(1～5318),然后利用5245位置上的FseⅠ酶切位点将最后两段连成HEV的全长cDNA。In-fusion法需要重新设计引物,使目的基因的两端带有载体两端的同源序列。虽然也涉及到PCR过程,但是以质粒为模板,难度相对overlap per要小,可以扩增3kb左右大小的片段用于连接。为了进一步保证这个HEV的全长cDNA克隆具有感染性,又对它进行了修正。在测序之后发现5’端有94个碱基与原序列比对不上,另外在2467的位置多出了5个碱基,我们需要将这一段替换掉。为了保证序列的准确性,重新从病料中提取SAAS-JDY5株的RNA,进行反转录(RT-PCR)。设计套式特异性引物,并在5’端引入T7 RNA聚合酶启动子,进行巢式PCR (Nest-PCR)扩增出目的片段，用新的正确的片段替换掉原来错误的片段,获得正确的SAAS-JDY5株HEV的全长cDNA克隆。国内外学者在研究病毒反向遗传学时大部分是用传统的以限制性内切酶和连接酶为基础的DNA重组技术来构建病毒的基因组全长,本研究首次综合利用了overlap per,连接酶和In-fusion技术构建病毒基因组全长并比较了这几个方法的利弊,为戊型肝炎病毒的反向遗传学研究提供些新资料。