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第一部分细胞内荧光RT-PCR联合流式细胞术检测BCR/ABL融合基因方法的建立目的:本研究拟将FISH、PCR和FCM三种先进检测技术结合起来,建立起一种快速、敏感、特异的临床上实用的检测分子标志的方法。材料和方法:1.研究对象:阳性细胞系(携带有BCR-ABL融合基因):K562细胞系;阴性细胞系(不携带BCR-ABL融合基因):NB4细胞系。2.方法:培养收集K562细胞和NB4细胞,用多聚甲醛固定细胞(不同浓度,不同时间,选择最佳固定浓度及最佳固定时间),然后用蛋白酶K对细胞进行通透化处理(不同浓度,不同时间,选择最佳浓度及最佳时间),细胞内反转录获cDNA(优化反转录条件),用LUX荧光引物进行细胞内PCR扩增(优化PCR条件),用荧光显微镜和FCM分析结果。将K562细胞与正常人骨髓单个核细胞以1:100至1:100000不同比例混合,同时用普通RT-PCR和细胞内荧光RT-PCR联合FCM分析BCR/ABL融合基因转录,鉴定其敏感性。结果:1.在K562细胞系,99～100%的细胞呈阳性,表现出围绕细胞核出现较强的黄绿色荧光信号。而在NB4细胞系和正常对照则无阳性信号发现。2.用细胞内荧光RT-PCR联合流式细胞术检测BCR-ABL融和基因,当K562细胞与正常细胞的比率小于1/10~4时,用流式细胞检测不到阳性信号。3.普通RT-PCR:在K562细胞与正常细胞的比率小于1/10~4时,BCR/ABL融合基因阴性。结论:1.LUX引物可以用于细胞内RT-PCR。2.细胞内荧光RT-PCR联合流式细胞术可以用来定量检测BCR-ABL融和基因转录,其敏感性与普通RT-PCR相同。第二部分用细胞内荧光RT-PCR联合流式细胞术检测CML患者BCR/ABL融合基因目的:细胞内荧光RT-PCR联合流式细胞术定量检测12例CML患者的骨髓细胞BCR/ABL融合基因转录情况,并与RT-PCR及FISH结果相比较,来验证此方法的敏感性、特异性及实用性。材料和方法:1.研究对象:选择2006-2007年间在我院治疗的12例CML患者,其中5例为初治患者,3例为干扰素联合羟基脲治疗患者,治疗时间6-16个月,4例为伊马替尼治疗患者,治疗时间为2-12个月。2.方法:分离骨髓单个核细胞,用4%的多聚甲醛固定细胞后,用蛋白酶K(1 ug/ml)对细胞进行通透化处理,用LUX引物在悬浮的细胞内进行mRNA的逆转录和DNA的扩增,用荧光显微镜和流式细胞术分析结果。所有标本同时用普通RT-PCR和FISH检测BCR/ABL融合基因情况,并比较其结果。结果:1.RT-PCR的结果:9个慢性粒细胞白血病病人,包括5个初诊病人,3个用α-干扰素和羟基脲治疗后的病人和1个服用伊马替尼2个月的病人,RT-PCR结果阳性;而其他3个病人,正常对照和NB4细胞系,RT-PCR结果阴性。2.I-FISH结果:对照组5份标本BCR-ABL融合基因阳性细胞检出率为1.5～4.1%,平均值为2.28%,标准差为0.61%,分界值为4.11%。初诊的5个病人阳性细胞率86～96.5%;4个治疗后病人,包括3个用α-干扰素和羟基脲治疗后的病人和1个服用伊马替尼的病人,细胞阳性率为23～80%;其他3个用伊马替尼治疗的病人和NB4细胞系为BCR-ABL融合基因阴性(阳性细胞率＜4.11%)。3.细胞内RT-PCR结果:在12个CML病人中,5个初诊的病人,阳性细胞率为90～98%,3个用干扰素和羟基脲治疗的病人和1个用伊马替尼治疗的病人细胞阳性率为26～82.5%。其余3个用伊马替尼治疗的病人未发现阳性细胞。其结果与RT-PCR和FISH结果相同。结论:用LUX引物进行细胞内RT-PCR联合流式细胞术分析是一种快速、敏感、特异的检测BCR-ABL融和基因的方法。