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目的:制备一种抗人程序性死亡配体1（programmed death ligand-1,PD-L1）单克隆抗体（monoclonal antibody,m Ab）,并对其进行人源化,使之适用于临床检测和治疗研究;基于人源化PD-L1抗体,构建肿瘤相关抗原表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）特异性嵌合抗原受体和PD-L1抗体双修饰慢病毒载体表达系统。方法:（1）采用杂交瘤技术获得PD-L1抗体。重组人PD-L1胞外区-Fc融合蛋白常规腹部免疫5只BALB/c小鼠,每只3次,测定效价,取2只高效价鼠,冲击免疫后,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）融合,用PD-L1-his通过包被蛋白间接酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）筛选获得阳性克隆,小鼠腹腔注射杂交瘤制备腹水,经饱和硫酸铵沉淀和Protein G亲和层析纯化抗体,冻干备用。Western blot分析PD-L1抗体与PD-L1表达载体转染293T细胞的结合情况,流式细胞荧光分选技术（fluorescence activated cell sorting,FACS）和竞争ELISA检测PD-L1抗体对PD-1与PD-L1结合的阻断作用,ELISA分析m Ab类别,Fortebio Octet96测定亲和力,选择高分泌株进一步亚克隆,建立稳定系,通过ELISA进一步检测小型化PD-L1-sc Fv与PD-L1蛋白的结合活性。（2）采用互补决定区（complementarity-determining regions,CDRs）移植法,对鼠抗体人源化。抗体全长测序,获取鼠源PD-L1抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）的CDR序列,与免疫遗传学数据库（IMGT）比对分析,选择与鼠抗体序列相似度最高人源化抗体框架区（framework region,FR）,将鼠CDR区植入人源化抗体FR,亲本抗体的CDRs嫁接到人受体载体中以获得每种亲本抗体的5个人源化轻链和5个人源化重链,在HEK293T细胞中表达了25个人源化抗体,以在不同浓度下进行亲和力测定,并进行抗体亲和力排序。选择亲和力排序前3种纯化的抗体,最后,纯化与嵌合抗体具有相似结合亲和力的人源化抗体（VH+VL）,鉴定人源化抗体的特性。（3）EGFR和PD-L1双靶向嵌合抗原受体构建及表达。人EGFR m Ab杂交瘤,5’RACE技术扩增其轻链和重链可变区（VL、VH）基因,构建sc Fv,克隆至真核载体pc DNA3.1进行表达鉴定。基因合成EGFR特异性嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor,CAR,引入CD137协同信号胞内功能域）与人源化PD-L1-sc Fv借助2A序列连接,克隆入慢病毒p LVX-EF1a-IRES-Zs Green1表达载体,使用Lenti-X Packaging Single Shots（VSV-G）共同转染293T细胞,获得包装病毒,感染293V细胞,流式细胞仪（fluorescence activated cell sorter,FACS）测定CAR膜表达,ELISA检测CAR感染293V细胞上清PD-L1-sc Fv表达。同法将上述目的基因克隆入慢病毒GV401表达载体,制备慢病毒,其中膜表达型慢病毒（KL46407-1）感染激活人外周血T细胞,验证CAR膜表达。结果:（1）经过反复克隆,从初选的10株杂交瘤中,筛选出1株单克隆抗体（11E3）,能够与PD-L1蛋白高亲和力结合,亚类为Ig G2a,亲和力KD值为1.66×10-10mol/L,具备高度配受体封阻性能;（2）11E3经人源化改造后,亲和力稳定(2.67×10-10mol/L);（3）EGFR-sc Fv获得有效表达。进一步构建了EGFR-CAR和PD-L1双修饰慢病毒分泌型CAR（CTC0537-1）及膜表达型CAR（CTC0537-2）,其病毒感染293V细胞阳性率均为10%。对应慢病毒CTZ0431-1感染293V细胞后,细胞膜表面表达EGFR-sc Fv,检测培养上清存在PD-L1-sc Fv;慢病毒CTZ0431-2感染293V细胞后,细胞膜表面EGFR-sc Fv和PD-L1-sc Fv有效表达。膜双表达型慢病毒（KL46407-1）感染活化T细胞的CAR表达率为39.3%。结论:获得一组鼠抗人PD-L1杂交瘤,从中筛选到一株与人PD-L1蛋白具有高亲和力抗体,具有高度配受体封阻性能,潜在的应用于肿瘤PD-L1表型检测和抗PD-1治疗有效性评估;成功构建EGFR-CAR和PD-L1-sc Fv双表达慢病毒载体,EGFR-CAR中度结合亲和力,为EGFR靶向和PD-L1抗体双修饰CAR-T细胞的实体瘤治疗研究提供了关键工具。