论文部分内容阅读
苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa california multiple nuclear polyhedrosis virus，AcMNPV)是一种模式杆状病毒，也是微生物杀虫剂。BmKIT是一种来源于东亚钳蝎的昆虫特异性毒素蛋白，本实验室前期构建了重组杆状病毒AcMNPV-BmKIT，并发现其可以在感染早期加速宿主细胞中P53蛋白的表达，上调凋亡抑制因子p35基因的转录表达，具有更高的细胞毒性和抗虫活性。为了明确AcMNPV-BmKIT侵染宿主细胞后具体的作用机制，我们通过转录组学的方法分析了AcMNPV-BmKIT的侵染对Sf9细胞基因转录水平的影响。转录组数据的分析结果显示病毒侵染会对宿主细胞的翻译过程产生影响，因为杆状病毒侵染会激活宿主细胞中一系列的抗病毒反应，其中包括降低总蛋白的合成来抑制病毒的增殖。简而言之，病毒侵染后宿主细胞会激活eIF2α激酶来磷酸化eIF2α，抑制蛋白质翻译的起始过程，降低总蛋白的合成来抵抗病毒侵染。而AcMNPV表达的Ac-PK2蛋白可以抑制eIF2α激酶的激活，营救翻译起始。为了明确过表达Ac-PK2蛋白是否会提高AcMNPV的杀虫活性及其作用机制，本研究中我们构建了重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP/RFP，并进行了深入的研究。在此基础上，探讨了过表达Ac-PK2蛋白的重组病毒与AcMNPV-BmKIT共侵染后抗虫活性是否具有协同效应。本研究分为四部分：
第一部分转录组测序筛选AcMNPV-BmKIT侵染后Sf9细胞中的差异表达基因
为分析AcMNPV-BmKIT的抗虫机制，了解AcMNPV-BmKIT侵染对Sf9细胞转录水平的影响，我们在AcMNPV和AcMNPV-BmKIT侵染72h后提取了Sf9细胞的RNA并进行反转录，通过Solexa测序进行了转录水平的分析。三个处理组中共鉴定出61269个转录本，其中在对照组control(C)的Sf9细胞中检测到54189个转录本，在AcMNPV(AT)侵染的Sf9细胞中检测到57979个转录本，在AcMNPV-BmKIT(ABT)侵染的Sf9细胞中检测到56575个转录本。对分析到的蛋白质序列进行KOG功能分类预测，共有7711个蛋白被注释上26种KOG分类。对蛋白进行KEGG注释，其中有4874个蛋白共注释上4211个KO，2853个基因共注释上339个pathway。总共鉴定出957个差异表达基因：第一组(ABT相对AT，ABTV.S.AT)中共分析到38个表达上调的基因，135个表达下调的基因；第二组(ABT相对C，ABTV.S.C)中共分析到129个表达上调的基因，84个表达下调的基因；在最后一组(AT相对于C，ATV.S.C)中，分析到459个表达上调的基因，112个表达下调的基因。我们从这些差异表达基因中选取了11个基因进行了qPCR验证，qPCR的结果与转录组测序的结果基本一致。差异表达基因的KEGG、GO功能分析的结果显示AcMNPV和AcMNPV-BmKIT对宿主细胞中DNA复制、蛋白质翻译等细胞过程相关的基因表达有影响。文献调研发现，宿主细胞可以通过降低总蛋白合成来抵抗病毒侵染，而AcMNPV表达的Ac-PK2蛋白可以营救蛋白翻译，那么过表达Ac-PK2蛋白是否可以提高AcMNPV的细胞毒力和抗虫活性，我们进行了进一步的研究。
第二部分AcMNPV-PK2-EGFP对宿主细胞能量代谢和子代病毒产量的影响
首先，利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒重组表达系统构建了过表达Ac-PK2蛋白的重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP。用5MOI的重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP侵染Sf9细胞，荧光显微镜观察与Westernblot分析结果表明，PK2-EGFP融合蛋白表达量从24h开始随着侵染时间的延长而逐渐增加，并在72h达到最高水平。相较于野生型病毒AcMNPV处理组，重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP侵染48h后Sf9细胞内eIF2α磷酸化逐渐减少。葡萄糖消耗的检测结果发现，AcMNPV-PK2-EGFP处理组能量消耗增加，葡萄糖的消耗速率在36、48、60h显著高于野生型病毒处理组，分别是野生型病毒处理组的1.11倍、1.2倍、1.34倍。AcMNPV-PK2-EGFP处理组培养液中乳酸积累从48h开始显著低于野生型病毒处理组，但与未处理组无明显差异。细胞内的ATP含量在病毒侵染后48、60、72h，即Ac-PK2蛋白开始过表达之后有一个显著的增加，分别是野生型病毒处理组的1.12倍、1.09倍、1.10倍。AcMNPV-PK2-EGFP处理组己糖激酶(hexokinase，HK)的活性在48、60h显著高于未处理组，分别是未处理组的1.21倍、1.16倍。噬斑实验的结果显示AcMNPV-PK2-EGFP处理组在病毒侵染后48、72h，子代病毒的产量显著高于野生型病毒处理组，缺失ac-pk2基因的重组病毒侵染会导致子代病毒的产量降低。这些结果表明重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP的侵染可以对宿主细胞能量代谢产生影响，为子代病毒的复制产生提供更有利的环境。既然重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP可以增加子代病毒的产量，那么AcMNPV-PK2-EGFP的侵染是否会加速宿主细胞的凋亡，我们进行了进一步的研究。
第三部分AcMNPV-PK2-RFP加速宿主细胞凋亡的机制分析
流式细胞术分析结果显示，重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP侵染Sf9细胞48、72h后，细胞凋亡比例显著高于野生型病毒处理组。为研究AcMNPV-PK2-EGFP加速宿主细胞凋亡的机制，本节中我们构建了带红色荧光蛋白的过表达Ac-PK2的重组病毒AcMNPV-PK2-RFP。ROS活性检测结果显示AcMNPV-PK2-RFP处理组Sf9细胞中活性氧的水平在48、72h显著高于野生型病毒处理组。线粒体膜电位检测发现AcMNPV-PK2-RFP处理组在病毒侵染后24、48、72h细胞内绿色荧光的强度均高于野生型病毒处理组，说明AcMNPV-PK2-RFP处理组线粒体膜电位低于野生型病毒处理组。Westernblot的结果表明AcMNPV-PK2-RFP处理组SfP53蛋白的表达在病毒侵染后48、60、72h均显著高于野生型病毒处理组，是野生型病毒处理组的1.16倍、1.39倍、1.79倍。接着，我们通过Westernblot检测了细胞色素c在线粒体和胞质的分布情况，结果显示两种病毒处理组均会影响细胞色素c的释放，相较于野生型病毒处理组而言，AcMNPV-PK2-RFP的处理组线粒体中的细胞色素c明显减少，细胞色素c的释放提前，从24h开始逐渐增加。根据以上结果，我们推测AcMNPV和AcMNPV-PK2-RFP侵染Sf9细胞后通过刺激线粒体凋亡信号通路加速宿主细胞的凋亡，因为过表达Ac-PK2蛋白的重组病毒可以增加子代病毒的产量，新产生的子代病毒会对细胞进行二次侵染，从而加速了AcMNPV-PK2-RFP处理组线粒体凋亡途径的激活。
第四部分AcMNPV-PK2-EGFP的抗虫活性及侵染甜菜夜蛾幼虫的机制分析
前面两部分的实验结果表明，过表达Ac-PK2蛋白的重组病毒AcMNPVP-PK2-EGFP/RFP可以调控宿主细胞能量代谢，帮助子代病毒复制，加速宿主细胞的凋亡。那么重组病毒AcMNPVP-PK2-EGFP是否具有更高的抗虫活性？我们进行了虫体水平的实验。qPCR的结果显示重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP侵染后可以上调Ac-pk2基因在中肠组织和神经索组织的表达，AcMNPV-PK2-EGFP与AcMNPV-BmKIT共侵染后，可以增加BmKIT在中肠组织和神经索组织的表达，并且在病毒侵染的早期，解毒相关基因sod、p450、cat的表达也会受到影响。Westernblot的结果显示AcMNPV处理组和AcMNPV-BmKIT+AcMNPV处理组，eIF2α的磷酸化随着侵染时间逐渐增加，AcMNPV-PK2-EGFP处理组eIF2α的磷酸化在病毒侵染后4h达到最大值，8至12h逐渐减少。AcMNPV-PK2-EGFP+AcMNPV-BmKIT处理组，eIF2α的磷酸化在病毒侵染后8h达到最大值，12h开始减少，说明相较于野生型病毒，过表达Ac-PK2蛋白的重组病毒的侵染可以减少甜菜夜蛾幼虫中肠组织eIF2a的磷酸化，有利于子代病毒的复制。同时，我们观察到各病毒处理组P53蛋白在病毒侵染1h后开始表达，病毒侵染4、8、12h后AcMNPV-BmKIT+AcMNPV-PK2-EGFP处理组P53蛋白的表达显著高于AcMNPV、AcMNPV-PK2-EGFP、AcMNPV-BmKIT+AcMNPV病毒处理组，说明重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP和AcMNPV-BmKIT共处理可以加速甜菜夜蛾幼虫中肠组织细胞的凋亡。酚氧化酶活性检测的结果显示，AcMNPV-BmKIT+AcMNPV-PK2-EGFP处理组酚氧化酶活性在4h达到最大值，分别是AcMNPV、AcMNPV-PK2-EGFP、AcMNPV-BmKIT+AcMNPV处理组4h的1.58倍、1.25倍、1.18倍。我们统计了对照组及病毒处理组甜菜夜蛾幼虫的平均体重、致死率、蛹化率、羽化率，四个处理组甜菜夜蛾幼虫的死亡率分别为54.78%、76.6%、83.3%、90%，对应的蛹化率分别为33.3%、26.67%、20%、16.67%，羽化率分别为20%、16.67%、13.3%、10%。可以看到，相较于AcMNPV处理组，AcMNPV-PK2-EGFP处理组的幼虫致死率显著增高，蛹化率、羽化率降低，说明AcMNPV-PK2-EGFP具有更高的抗虫活性。相较于AcMNPV+AcMNPV-BmKIT处理组，AcMNPV-PK2-EGFP+AcMNPV-BmKIT处理组甜菜夜蛾幼虫的羽化时间推迟，蛹化率和羽化率均降低，最终的致死率显著提高。综合上述结果，AcMNPV-PK2-EGFP相较于野生型病毒而言具有较高的抗虫活性，AcMNPV-PK2-EGFP和AcMNPV-BmKIT共处理会使得抗虫活性进一步升高。这部分的结果在虫体水平上解析了重组杆状病毒AcMNPV-PK2-EGFP、AcMNPV-BmKIT经口服感染后通过影响解毒相关基因(sod、p450、cat)的表达、酚氧化酶的活性，调控中肠组织eIF2α的磷酸化以及凋亡相关蛋白P53的表达来增加宿主昆虫的死亡率，明确了重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP和AcMNPV-BmKIT抗虫活性存在协同效应。
综上所述，本研究通过转录组学的方法分析了AcMNPV-BmKIT侵染对Sf9细胞转录水平的影响，鉴定了900多个差异表达基因，并进行了qPCR验证。我们构建了过表达Ac-PK2蛋白的重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP/RFP，在细胞水平上分析了AcMNPV侵染宿主过程中过表达Ac-PK2蛋白对宿主细胞能量代谢和子代病毒产量的影响，明确了重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP通过影响线粒体凋亡信号通路加速宿主细胞凋亡的机制，并且在虫体水平上分析了重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP的抗虫活性及作用机制，明确了AcMNPV-PK2-EGFP与AcMNPV-BmKIT共侵染可以增强AcMNPV-BmKIT的抗虫活性。本研究为杆状病毒的抗虫机制研究及应用提供了实验依据，对科学防治鳞翅目害虫具有重要意义。
第一部分转录组测序筛选AcMNPV-BmKIT侵染后Sf9细胞中的差异表达基因
为分析AcMNPV-BmKIT的抗虫机制，了解AcMNPV-BmKIT侵染对Sf9细胞转录水平的影响，我们在AcMNPV和AcMNPV-BmKIT侵染72h后提取了Sf9细胞的RNA并进行反转录，通过Solexa测序进行了转录水平的分析。三个处理组中共鉴定出61269个转录本，其中在对照组control(C)的Sf9细胞中检测到54189个转录本，在AcMNPV(AT)侵染的Sf9细胞中检测到57979个转录本，在AcMNPV-BmKIT(ABT)侵染的Sf9细胞中检测到56575个转录本。对分析到的蛋白质序列进行KOG功能分类预测，共有7711个蛋白被注释上26种KOG分类。对蛋白进行KEGG注释，其中有4874个蛋白共注释上4211个KO，2853个基因共注释上339个pathway。总共鉴定出957个差异表达基因：第一组(ABT相对AT，ABTV.S.AT)中共分析到38个表达上调的基因，135个表达下调的基因；第二组(ABT相对C，ABTV.S.C)中共分析到129个表达上调的基因，84个表达下调的基因；在最后一组(AT相对于C，ATV.S.C)中，分析到459个表达上调的基因，112个表达下调的基因。我们从这些差异表达基因中选取了11个基因进行了qPCR验证，qPCR的结果与转录组测序的结果基本一致。差异表达基因的KEGG、GO功能分析的结果显示AcMNPV和AcMNPV-BmKIT对宿主细胞中DNA复制、蛋白质翻译等细胞过程相关的基因表达有影响。文献调研发现，宿主细胞可以通过降低总蛋白合成来抵抗病毒侵染，而AcMNPV表达的Ac-PK2蛋白可以营救蛋白翻译，那么过表达Ac-PK2蛋白是否可以提高AcMNPV的细胞毒力和抗虫活性，我们进行了进一步的研究。
第二部分AcMNPV-PK2-EGFP对宿主细胞能量代谢和子代病毒产量的影响
首先，利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒重组表达系统构建了过表达Ac-PK2蛋白的重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP。用5MOI的重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP侵染Sf9细胞，荧光显微镜观察与Westernblot分析结果表明，PK2-EGFP融合蛋白表达量从24h开始随着侵染时间的延长而逐渐增加，并在72h达到最高水平。相较于野生型病毒AcMNPV处理组，重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP侵染48h后Sf9细胞内eIF2α磷酸化逐渐减少。葡萄糖消耗的检测结果发现，AcMNPV-PK2-EGFP处理组能量消耗增加，葡萄糖的消耗速率在36、48、60h显著高于野生型病毒处理组，分别是野生型病毒处理组的1.11倍、1.2倍、1.34倍。AcMNPV-PK2-EGFP处理组培养液中乳酸积累从48h开始显著低于野生型病毒处理组，但与未处理组无明显差异。细胞内的ATP含量在病毒侵染后48、60、72h，即Ac-PK2蛋白开始过表达之后有一个显著的增加，分别是野生型病毒处理组的1.12倍、1.09倍、1.10倍。AcMNPV-PK2-EGFP处理组己糖激酶(hexokinase，HK)的活性在48、60h显著高于未处理组，分别是未处理组的1.21倍、1.16倍。噬斑实验的结果显示AcMNPV-PK2-EGFP处理组在病毒侵染后48、72h，子代病毒的产量显著高于野生型病毒处理组，缺失ac-pk2基因的重组病毒侵染会导致子代病毒的产量降低。这些结果表明重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP的侵染可以对宿主细胞能量代谢产生影响，为子代病毒的复制产生提供更有利的环境。既然重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP可以增加子代病毒的产量，那么AcMNPV-PK2-EGFP的侵染是否会加速宿主细胞的凋亡，我们进行了进一步的研究。
第三部分AcMNPV-PK2-RFP加速宿主细胞凋亡的机制分析
流式细胞术分析结果显示，重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP侵染Sf9细胞48、72h后，细胞凋亡比例显著高于野生型病毒处理组。为研究AcMNPV-PK2-EGFP加速宿主细胞凋亡的机制，本节中我们构建了带红色荧光蛋白的过表达Ac-PK2的重组病毒AcMNPV-PK2-RFP。ROS活性检测结果显示AcMNPV-PK2-RFP处理组Sf9细胞中活性氧的水平在48、72h显著高于野生型病毒处理组。线粒体膜电位检测发现AcMNPV-PK2-RFP处理组在病毒侵染后24、48、72h细胞内绿色荧光的强度均高于野生型病毒处理组，说明AcMNPV-PK2-RFP处理组线粒体膜电位低于野生型病毒处理组。Westernblot的结果表明AcMNPV-PK2-RFP处理组SfP53蛋白的表达在病毒侵染后48、60、72h均显著高于野生型病毒处理组，是野生型病毒处理组的1.16倍、1.39倍、1.79倍。接着，我们通过Westernblot检测了细胞色素c在线粒体和胞质的分布情况，结果显示两种病毒处理组均会影响细胞色素c的释放，相较于野生型病毒处理组而言，AcMNPV-PK2-RFP的处理组线粒体中的细胞色素c明显减少，细胞色素c的释放提前，从24h开始逐渐增加。根据以上结果，我们推测AcMNPV和AcMNPV-PK2-RFP侵染Sf9细胞后通过刺激线粒体凋亡信号通路加速宿主细胞的凋亡，因为过表达Ac-PK2蛋白的重组病毒可以增加子代病毒的产量，新产生的子代病毒会对细胞进行二次侵染，从而加速了AcMNPV-PK2-RFP处理组线粒体凋亡途径的激活。
第四部分AcMNPV-PK2-EGFP的抗虫活性及侵染甜菜夜蛾幼虫的机制分析
前面两部分的实验结果表明，过表达Ac-PK2蛋白的重组病毒AcMNPVP-PK2-EGFP/RFP可以调控宿主细胞能量代谢，帮助子代病毒复制，加速宿主细胞的凋亡。那么重组病毒AcMNPVP-PK2-EGFP是否具有更高的抗虫活性？我们进行了虫体水平的实验。qPCR的结果显示重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP侵染后可以上调Ac-pk2基因在中肠组织和神经索组织的表达，AcMNPV-PK2-EGFP与AcMNPV-BmKIT共侵染后，可以增加BmKIT在中肠组织和神经索组织的表达，并且在病毒侵染的早期，解毒相关基因sod、p450、cat的表达也会受到影响。Westernblot的结果显示AcMNPV处理组和AcMNPV-BmKIT+AcMNPV处理组，eIF2α的磷酸化随着侵染时间逐渐增加，AcMNPV-PK2-EGFP处理组eIF2α的磷酸化在病毒侵染后4h达到最大值，8至12h逐渐减少。AcMNPV-PK2-EGFP+AcMNPV-BmKIT处理组，eIF2α的磷酸化在病毒侵染后8h达到最大值，12h开始减少，说明相较于野生型病毒，过表达Ac-PK2蛋白的重组病毒的侵染可以减少甜菜夜蛾幼虫中肠组织eIF2a的磷酸化，有利于子代病毒的复制。同时，我们观察到各病毒处理组P53蛋白在病毒侵染1h后开始表达，病毒侵染4、8、12h后AcMNPV-BmKIT+AcMNPV-PK2-EGFP处理组P53蛋白的表达显著高于AcMNPV、AcMNPV-PK2-EGFP、AcMNPV-BmKIT+AcMNPV病毒处理组，说明重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP和AcMNPV-BmKIT共处理可以加速甜菜夜蛾幼虫中肠组织细胞的凋亡。酚氧化酶活性检测的结果显示，AcMNPV-BmKIT+AcMNPV-PK2-EGFP处理组酚氧化酶活性在4h达到最大值，分别是AcMNPV、AcMNPV-PK2-EGFP、AcMNPV-BmKIT+AcMNPV处理组4h的1.58倍、1.25倍、1.18倍。我们统计了对照组及病毒处理组甜菜夜蛾幼虫的平均体重、致死率、蛹化率、羽化率，四个处理组甜菜夜蛾幼虫的死亡率分别为54.78%、76.6%、83.3%、90%，对应的蛹化率分别为33.3%、26.67%、20%、16.67%，羽化率分别为20%、16.67%、13.3%、10%。可以看到，相较于AcMNPV处理组，AcMNPV-PK2-EGFP处理组的幼虫致死率显著增高，蛹化率、羽化率降低，说明AcMNPV-PK2-EGFP具有更高的抗虫活性。相较于AcMNPV+AcMNPV-BmKIT处理组，AcMNPV-PK2-EGFP+AcMNPV-BmKIT处理组甜菜夜蛾幼虫的羽化时间推迟，蛹化率和羽化率均降低，最终的致死率显著提高。综合上述结果，AcMNPV-PK2-EGFP相较于野生型病毒而言具有较高的抗虫活性，AcMNPV-PK2-EGFP和AcMNPV-BmKIT共处理会使得抗虫活性进一步升高。这部分的结果在虫体水平上解析了重组杆状病毒AcMNPV-PK2-EGFP、AcMNPV-BmKIT经口服感染后通过影响解毒相关基因(sod、p450、cat)的表达、酚氧化酶的活性，调控中肠组织eIF2α的磷酸化以及凋亡相关蛋白P53的表达来增加宿主昆虫的死亡率，明确了重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP和AcMNPV-BmKIT抗虫活性存在协同效应。
综上所述，本研究通过转录组学的方法分析了AcMNPV-BmKIT侵染对Sf9细胞转录水平的影响，鉴定了900多个差异表达基因，并进行了qPCR验证。我们构建了过表达Ac-PK2蛋白的重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP/RFP，在细胞水平上分析了AcMNPV侵染宿主过程中过表达Ac-PK2蛋白对宿主细胞能量代谢和子代病毒产量的影响，明确了重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP通过影响线粒体凋亡信号通路加速宿主细胞凋亡的机制，并且在虫体水平上分析了重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP的抗虫活性及作用机制，明确了AcMNPV-PK2-EGFP与AcMNPV-BmKIT共侵染可以增强AcMNPV-BmKIT的抗虫活性。本研究为杆状病毒的抗虫机制研究及应用提供了实验依据，对科学防治鳞翅目害虫具有重要意义。