目的:糖尿病,特别是2型糖尿病是近年来国内外共同关注的热点之一,胰岛素抵抗是2型糖尿病的基本特征,也是导致2型糖尿病的关键危险因素。2001年美国糖尿病协会(ADA)会议上有学者指出,脂代谢异常与2型糖尿病的发生发展的关系比与糖代谢异常的关系更为密切,在2型糖尿病中,脂代谢紊乱是糖代谢紊乱的根源,是糖尿病及其并发症的原发性病理生理改变。血中及组织中的游离脂肪酸的升高会引起脂毒作用,进而引起胰岛素抵抗和糖尿病。因此,脂肪酸谱的研究对于糖尿病的研究有重要意义。胰岛素抵抗与糖尿病状态下,机体糖利用障碍,脂肪动员加强,脂肪酸氧化供能成为机体的主要能量来源。脂肪酸在细胞内的氧化主要有两条途径:一是进入线粒体进行β氧化,这条途径主要氧化中短链脂肪酸及长链脂肪酸(LCFA);二是进入过氧化物酶体进行β氧化,分解成短链脂肪酸。后者再经线粒体β氧化彻底分解提供能量。该途径主要氧化极长链脂肪酸(CLCFA),多不饱和脂肪酸(PUFA,包括:n-3 PUFA, n-6PUFA))以及部分长链脂肪酸。这两条途径共同维持着脂肪酸在细胞内的动态平衡,任何途径障碍,都将导致脂肪酸在血和组织中聚集,导致胰岛素抵抗和糖尿病。其中,由过氧化物酶体β氧化途径分解的极长链脂肪酸的蓄积,对细胞的损伤更大。目前已有的研究发现,糖尿病状态下,患者血清中的总游离脂肪酸含量较正常人高,其中饱和脂肪酸(SFA)的含量升高,但C16:0、C18:0占总脂肪酸的比例降低;糖尿病大鼠的血清、肝组织、心肌组织、脑组织、肾组织的脂肪酸含量也有显著变化。但是,在上述组织中,哪些脂肪酸升高了,哪些脂肪酸在胰岛素抵抗与糖尿病的发生发展中起了关键作用?是否是过氧化物酶体代谢相关的极长链脂肪酸?未见报道。为此,本文对此进行了相关研究。常用毛细管气相色谱法对脂肪酸进行定性、定量的测定。因为脂肪酸的热稳定性较差,须先对样品中的脂肪酸进行甲酯化处理,并抽提后再进行色谱测定,但目前尚无较好的可以同时测定C16-C26的饱和与不饱和脂肪酸谱的色谱条件,甲酯化C16-C26脂肪酸的高效方法,以及抽提脂肪酸甲酯的方法。基于上述目的,本实验首先确立了确定了气相色谱测定C16-C26的饱和与不饱和脂肪酸谱的条件,优化了大鼠血清及肝组织、心肌组织、脑组织、肾组织的脂肪酸甲酯化方法和脂肪酸甲酯的提取方法,并用此方法测定分析了高脂饮食诱导的单纯胰岛素抵抗及糖尿病SD大鼠的血清、肝组织、心肌组织、脑组织、肾组织中C16-C26的饱和与不饱和脂肪酸谱的变化,从而从游离脂肪酸的角度,探讨其在胰岛素抵抗与糖尿病的发生发展中的作用。方法:1气相色谱测定脂肪酸谱的方法的建立选用极性柱:Agilent DB-WAX聚乙二醇毛细管柱(30 m×0.53 mm×1.00μm),将传统的单阶升温程序改进为三平台二阶升温程序,在第一阶升温与第二阶升温之间添加一个190℃的58min的平台期,以改进后的方法对脂肪酸甲酯标准品混合液进行测定,观察改进后的方法对于C16-C26的各种饱和与不饱和脂肪酸甲酯的分离效果,并测定保留时间,测定并计算标准曲线、最低检出限、回收率及日内日间相对标准偏差。2样本游离脂肪酸的甲酯化及抽提条件的优化以SD大鼠的肝组织为对象进行探讨,比较并将确定甲酯化试剂,及甲酯化后的最佳抽提次数,测定优化的方法的批内及批间相对标准偏差。3以优化后的方法确定血清及组织的最适用量。4大鼠血清及组织脂肪酸谱的测定分别取正常组、单纯胰岛素抵抗组、糖尿病组SD大鼠的血清、肝组织、心肌组织、脑组织、肾组织以已确定的方法进行甲酯化、抽提并按已确定的方法进行色谱分离,计算脂肪酸含量。5数据处理数据用?x±s表示,采用SPSS 13.0软件进行统计学分析,对所测定结果进行正态性及方差齐性检验,单纯胰岛素抵抗组和糖尿病组均与对照组比较,用student’s t检验(双尾),检验以P<0.05为差异有统计学意义。结果:1气相色谱测定脂肪酸谱的方法的建立1.1色谱条件的确定1.1.1色谱条件最终确定为:Agilent DB-WAX聚乙二醇毛细管柱(30 m×0.53 mm×1.00μm);初始柱温150℃,10℃/ min升温至190℃,保持58min; 20℃/ min升温至230℃,保持15 min;氮气流量25ml/ min,氢气流量30ml/ min,空气流量400ml/min。进样1μl。改进后的色谱条件可将C16:0、C16:1、C18:0、C18:1、C18:2、C18:3、C20:0、C20:4、C20:5、C22:0、C22:4、C22:5、C22:6、C24:0、C26:0十五种脂肪酸甲酯标准品一次分离,分离效果较好。1.2保留时间的确定各种标准脂肪酸甲酯的保留时间分别为: C16:0 7.104±0.012 min; C16:1 7.522±0.027 min; C18:0 11.023±0.009 min; C18:1 11.594±0.020 min; C18:2 13.024±0.012 min; C18:3 15.390±0.008 min; C20:0 18.300±0.022 min; C20:4 25.385±0.014 min; C20:5 30.647±0.009 min; C22:0 32.232±0.014 min; C22:4 45.697±0.017 min; C22:5 55.726±0.022 min; C24:0 58.611±0.010 min; C22:6 60.815±0.018 min; C26:0 71.426±0.025 min。1.3标准曲线的确定根据标准曲线得出的各脂肪酸甲酯的直线方程分别为: C16:0 Y=1587.9X+2690(R~2=0.9997); C16:1 Y=1704.4X+48.867(R~2=0.9998);C18:0 Y=1731.8X+1041.6(R~2=0.9997); C18:1 Y=1719.5X+3260.7(R~2=0.9997); C18:2 Y=3194.0X-1262.8( R~2=0.9990); C18:3 Y=3326.2X+32.191(R~2=0.9997); C20:0 Y=4978.2X-199.33(R~2=0.9974); C20:4 Y=1787.6X-742.95(R~2=0.9991); C20:5 Y=2057.8X-43.33(R~2=0.9990); C22:0 Y=1939.3X-47.97(R~2=0.9988); C22:4 Y=1200.5X+210.13(R~2=0.9998); C22:5 Y=3006.3X+290.76(R~2=0.9998); C24:0 Y=1783.3X+45.32(R~2=0.9993); C22:6 Y=2673.1X-358.81(R~2=0.9992); C26:0 Y=2192.9X+95.102(R~2=0.9985)。1.4最低检出限的确定各种脂肪酸甲酯的最低检出限分别为: C16:0 0.0783μg/ml; C16:1 0.0730μg/ml; C18:0 0.0718μg/ml; C18:1 0.0723μg/ml; C18:2 0.0390μg/ml; C18:3 0.0374μg/ml; C20:0 0.0250μg/ml; C20:4 0.0696μg/ml; C20:5 0.0605μg/ml; C22:0 0.0641μg/ml; C22:4 0.1036μg/ml; C22:5 0.0414μg/ml; C24:0 0.0698μg/ml; C22:6 0.0465μg/ml; C26:0 0.0567μg/ml。1.5回收率的测定各种脂肪酸甲酯的回收率在95.2% -107.5%之间。1.6相对标准偏差的测定日内相对标准偏差范围为1.37% -3.29%,日间相对标准偏差范围为3.21% -5.74%。2样本游离脂肪酸的甲酯化及抽提条件的优化甲酯化试剂中,乙酰氯的催化效率最高;最佳抽提次数为三次;批内相对标准偏差范围为1.94%-8.62%,批间相对标准偏差范围为2.33% -11.60%。3用于脂肪酸测定的血清及组织的最适用量血清、肝组织、心肌组织、脑组织、肾组织的最适用量分别为:800μl、800mg、800mg、65mg、500mg。4单纯胰岛素抵抗及糖尿病大鼠的血清、肝组织、心肌组织、脑组织、肾组织的游离脂肪酸的变化4.1与正常组相比较,胰岛素抵抗大鼠的脂肪酸谱的变化:血清中,总脂肪酸、SFA、UFA、SFA/UFA、n-3PUFA、n-3PUFA/ n-6PUFA、LCFA、VLCFA显著升高, n-6PUFA显著降低,差异均有统计学意义。肝组织中, SFA/UFA、n-3PUFA/ n-6PUFA显著升高, n-3PUFA、n-6PUFA显著降低,差异均有统计学意义。心肌组织中,总脂肪酸、SFA、UFA、SFA/UFA、LCFA显著升高,差异均有统计学意义。脑组织中, n-3PUFA、VLCFA显著降低,差异均有统计学意义。肾组织中,总脂肪酸、SFA、UFA、SFA/UFA、LCFA显著升高, n-3PUFA显著降低,差异均有统计学意义。4.2与正常组相比较,糖尿病大鼠的脂肪酸谱的变化:血清中,总脂肪酸、SFA、UFA、SFA/UFA、LCFA、VLCFA有显著升高, n-3PUFA、n-3PUFA/ n-6PUFA显著降低,差异均有统计学意义。肝组织中, SFA/UFA、n-3PUFA、n-3PUFA/ n-6PUFA、VLCFA有显著升高, UFA、n-6PUFA显著降低,差异均有统计学意义。心肌组织中,总脂肪酸、SFA、UFA、n-6PUFA、LCFA显著升高, SFA/UFA、n-3PUFA、n-3PUFA/ n-6PUFA、VLCFA显著降低,差异均有统计学意义。脑组织中,SFA/UFA显著升高,总脂肪酸、UFA、n-3PUFA、n-6PUFA、n-3PUFA/ n-6PUFA、LCFA、VLCFA显著降低,差异均有统计学意义。肾组织中,总脂肪酸、SFA、UFA、SFA/UFA、LCFA显著升高, n-3PUFA、n-6PUFA、n-3PUFA/ n-6PUFA、VLCFA显著降低,差异均有统计学意义。4.3与胰岛素抵抗组相比较,糖尿病大鼠的脂肪酸谱的变化:血清中,n-6PUFA显著升高,SFA/UFA、n-3PUFA、n-3PUFA/ n-6PUFA、VLCFA显著降低,差异均有统计学意义。肝组织中, n-3PUFA、n-3PUFA/ n-6PUFA、VLCFA显著升高,差异均有统计学意义。心肌组织中,总脂肪酸、UFA、n-6PUFA、LCFA显著升高, SFA/UFA、n-3PUFA、n-3PUFA/ n-6PUFA、VLCFA显著降低,差异均有统计学意义。脑组织中,SFA/UFA显著升高, UFA、n-3PUFA、n-3PUFA/ n-6PUFA有显著降低,差异均有统计学意义。肾组织中, n-3PUFA、n-6PUFA、n-3PUFA/ n-6PUFA、VLCFA显著降低,以上差异均有统计学意义。结论:1建立了气相色谱测定C16-C26的游离脂肪酸谱的方法。方法的重复性和准确性良好,可作为C16-C26游离脂肪酸谱常规检测的有用工具。2胰岛素抵抗及糖尿病状态下,血清中的脂肪酸含量的升高涉及长链及极长链脂肪酸水平的升高。3单纯胰岛素抵抗状态及糖尿病状态下,SD大鼠的肝组织、心肌组织、脑组织、肾组织中脂肪酸谱的变化各不相同:肝组织中,总脂肪酸含量的升高与极长链脂肪酸的升高有关,其中C22:6升高显著;心肌组织中,总脂肪酸含量的升高与长链脂肪酸的升高有关,但是C22:6降低显著;脑组织中,总脂肪酸含量的升高与C16以上的脂肪酸无关,C22:6显著降低;肾组织中,总脂肪酸含量的升高与长链脂肪酸的升高有关,C22:6显著降低。