慢性炎症疾病，如风湿性关节炎、牙周炎等，是最为常见的引起骨质破坏的一类疾病。慢性炎症影响骨组织的再生与修复能力，其原因可能是炎症通过改变成体干细胞的微环境，从而影响内源性干细胞的生物学特性。近年来发现的牙周膜干细胞（Periodontal ligament stem cells，PDLSCs），因具有多向分化以及自我更新潜能，已成为骨再生的重要种子细胞。本实验组前期研究证明，在慢性炎症微环境中，PDLSCs的骨向分化能力受到明显抑制，而如何恢复并增强其骨向分化能力是牙周再生成功的关键。信号通路（如Wnt、TGF-β、BMP、Hedgehog等）在转录水平对干细胞骨向分化起着至关重要的调控作用。而MicroRNA（miRNA）的发现，又将干细胞分化的调控热点引入转录后水平时代。miRNA是一类长约19~24个核苷酸的小分子非编码（Non-coding）RNA，它们能够识别特定的靶基因，并负向调控其表达。研究表明miRNA对干细胞增殖和分化过程起到了重要的调控作用。在生物体内，各种生命活动是以相互关联的信号通路（Signalingpathway）来执行的，彼此关联的信号通路构成复杂的调控网络。研究发现，miRNA更倾向于选择信号转导通路上的蛋白作为靶基因，因而能够在转录后水平对信号通路进行精确的调控。此外，miRNA因其靶基因数量庞大且种类繁多，能够广泛地参与到基因调控网络中，从而发挥多种生物学作用。因此，本课题拟通过PDLSCs成骨相关性miRNAs表达谱的建立及特异性miR-17的筛选与确定；miR-17在PDLSCs骨向分化中的生物学作用研究以及miR-17调控PDLSCs骨向分化的作用机制研究三部分实验深入研究miR-17调控PDLSCs骨向分化中的分子机制，将有助于明确组织特异性干细胞骨向分化的分子机制，为提高牙周组织再生过程中种子细胞的分化能力提供理论依据，将有助于优化miRNA介导的干细胞相关组织再生的治疗方法。第一部分PDLSCs成骨相关性miRNAs表达谱的建立及miR-17的筛选与确定研究目的（1）体外分离培养并鉴定PDLSCs的生物学特性；（2）建立人PDLSCs成骨诱导前后miRNAs差异表达谱；（3）筛选及确定在人PDLSCs骨向分化过程中，特异性发生改变的miRNAs；研究方法（1）使用有限稀释法单克隆分离培养PDLSCs；细胞免疫荧光染色及流式细胞仪进行表面标记的检测；克隆形成能力检测增殖情况； Real-timePCR对成骨以及成脂分化的关键基因进行检测；（2）采用Exiqon公司的miRCURY LNA Array v.11.0芯片对正常及成骨诱导后PDLSCs差异miRNAs进行筛选；Real-time PCR对芯片结果进行验证；（3） Real-time PCR检测miR-17在PDLSCs成骨分化过程中的表达时相；实验结果（1）使用有限稀释法分离培养的PDLSCs，免疫荧光染色结果显示间充质干细胞表面标记STRO-1（14.7%）、CD146（89.3%）、CD29（98.6%）、CD90（99.9%）和CD105（99.9%）阳性，造血分子表面标记CD31（2.4%）和CD34（3.7%）阴性；克隆形成能力38%；Real-time PCR结果显示成骨相关基因Runx2、ALP、OCN和OPN，以及成脂相关基因PPARγ和LPL诱导后均显著上调；（2）聚类分析miRNA芯片结果，发现有52个miRNAs上调，51个miRNAs下调，29个miRNAs的变化具有统计学意义（P<0.05）；选择2个下调的has-miR-17、has-miR-155，以及2个上调的miR-199a-5p、miR-214进行Real-time PCR验证芯片结果，芯片准确性良好；（3） Real-time PCR结果显示miR-17在PDLSCs骨向分化过程中表达下调，在第7天时达到最低，而后逐渐升高，但仍低于未诱导组；结论（1）有限稀释法分离培养的PDLSCs具有自我更新及多向分化潜能；（2）首次建立了人PDLSCs成骨分化前后的miRNAs表达谱，并发现内源性miR-17在PDLSCs骨向分化的过程中降低；第二部分miR-17在PDLSCs骨向分化中的生物学调控作用研究研究目的（1）明确miR-17在PDLSCs骨向分化中的功能；（2）明确miR-17-靶基因之间的相互作用，从而证明在PDLSCs的定向分化过程中，miR-17起着重要的调控作用；研究方法（1）通过细胞转染技术过表达和抑制miR-17，ALP、茜素红染色、Real-timePCR和Western blot技术观察转染后细胞成骨分化能力的差异；（2）生物信息学结合荧光素酶报告基因检测，确定miR-17的相关靶基因；实验结果（1）升高miR-17的表达后，ALP、茜素红染色，Real-time PCR及Westernblot检测成骨相关基因（Runx2、ALP）均表明PDLSCs的骨向分化能力受到显著抑制；反之，抑制内源性miR-17的表达后，PDLSCs的骨向分化能力增强；（2）荧光素酶报告基因检测结果表明，TCF3是miR-17的直接靶基因；结论（1） miR-17发挥负向调控PDLSCs骨向分化的作用；（2）经典Wnt信号通路关键转录因子TCF3是miR-17的直接靶基因；第三部分miR-17调控PDLSCs骨向分化的机制研究研究目的（1）明确TCF3对PDLSCs骨向分化的调控作用；（2）明确miR-17与靶基因TCF3所在经典Wnt信号通路之间的相互关系；研究方法（1）使用siRNA沉默TCF3的表达，ALP、茜素红染色、Real-time PCR及Western blot技术观察转染后细胞成骨分化能力的差异；（2） Western blot检测过表达和抑制miR-17后，胞核内β-catenin的表达情况；Real-time PCR检测加入Wnt3a或DKK-1后miR-17的表达情况；实验结果（1）沉默TCF3后，结果显示PDLSCs骨向分化能力明显受到抑制；在预先沉默TCF3的PDLSCs中，抑制内源性miR-17的表达并不能有效地增强PDLSCs的骨向分化能力；（2）过表达和抑制miR-17后，结果显示，β-catenin在mRNA水平基本没有变化，而胞核中β-catenin蛋白水平在升高miR-17后显著减少，反之，在下调内源性miR-17表达量后，胞核中β-catenin升高；其次，使用重组人Wnt3a蛋白和DKK-1蛋白激活和抑制Wnt通路后发现，Wnt3a能够显著抑制miR-17的表达量，而DKK-1则能够明显上调miR-17的表达量。结论（1）首次证明TCF3促进PDLSCs的骨向分化；（2）改变miR-17的表达量能够促进或者抑制β-catenin的入核，从而激活或者抑制Wnt通路，我们的结果表明miR-17能够调控经典Wnt通路；而激活或者阻断经典Wnt通路后miR-17的表达也发生变化。相比复杂的通路级联激活的程序，miR-17能够快速且简便的通过TCF3即可激活Wnt通路，从而发挥其强大的调控作用。