自交不亲和性（Self-incompatibility，SI）普遍存在于显花植物中，是植物在长期进化中形成的一种防止自交衰败、保持物种多样性的重要遗传机制。同时，自交不亲和系又是十字花科芸薹属作物杂交育种中重要的亲本材料。因此，深入开展自交不亲和信号传导机理的研究，即可为阐明植物胞间信号传导提供新的内容，也可为生产上利用自交不亲和系配制杂交种提供理论依据。　　过去人们普遍认为，十字花科孢子体型自交不亲和柱头内信号传导过程是沿着SRK-ARC1-Exo70A1途径进行，但是近年来的研究表明，在转基因欧洲油菜和琴叶拟南芥中抑制ARC1的表达或者超表达Exo70A1都只能部分打破材料的自交不亲和性，由此说明ARC1-Exo70A1信号通路可能只是SRK下游信号传递途径的一个分支。柱头内可能存在其他的SI信号元件和信号传递分支与ARC1-Exo70A1共同传递来自于SRK的下游信号。　　本研究以自交亲和芜菁突变体SCM1和SCM2、自交不亲和甘蓝A4为材料，扩增了SRK、SCR、MLPK、ARC1、Exo70A1基因编码序列，对SI相关基因做了序列和表达分析；成功构建了基于酵母双杂交的MLPK短截体诱饵蛋白，并利用其与ARC1互作验证了MLPK短截体诱饵蛋白可行性。在对甘蓝PUB家族基因全基因组鉴定和分析后，用构建的MLPK短截体诱饵蛋白筛选互作的PUB家族基因。取得了以下结果：　　（1）甘蓝、芜菁SI元件的克隆与表达分析　　以甘蓝A4，芜菁SCM1、SCM2的柱头和花粉cDNA为模版，通过高保真酶扩增三种材料的SRK、SCR、MLPKf1、MLPKf2、MLPKn1、ARC1、Exo70A1的基因，用荧光定量PCR分析这些SI相关基因在三种材料中的表达情况。经序列分析，SCR、ARC1、Exo70A1氨基酸序列在甘蓝和芜菁中具有较高的保守性，甘蓝SRK基因为S28单倍型，存在天然缺失的情况，既可以扩增到基因全长也能扩增到缺失突变体，两种芜菁材料SRK为f2单倍型，既可以扩增到SRK基因全长也能扩增到SRK缺失突变体。芜菁材料MLPK存在关键位点氨基酸突变，194位的甘氨酸G突变为精氨酸R，丧失了自体磷酸化能力。对SI基因的表达情况分析后发现，SI的各种关键元件在甘蓝和芜菁材料中都能正常表达，不同SI元件表达量在不同材料中互有高低。　　（2）MLPK诱饵蛋白构建及其与ARC1互作验证　　依据蛋白功能域分析，分别构建了MLPK和ARC1短截体，经过对MLPK和ARC1结构域进行生物信息学分析发现，MLPK包含蛋白激酶域；ARC1包含臂重复区、U-box、亮氨酸拉链和卷曲螺旋。MLPK为定位于膜上的受体激酶，为此我们构建了MLPK去掉膜定位序列的短截体，将构建的MLPK短截体亚克隆至pGADT7，将构建的ARC1短截体亚克隆至pGBKT7，用PEG/LiAc法实施转化至AH109酵母感受态，构建的MLPK、ARC1短截体均无自激活和毒性，互作分析表明MLPK-M3M4与ARC1臂重复区互作最强，MLPK-M2M4也能与ARC1臂重复区互作，其他组合均不能互作。　　（3）MLPK短截体的亚细胞定位研究　　为了分析酵母双杂交检测不到全长MLPK与ARC1相互作用是否与MLPK不能引入细胞核有关。我们通过亚细胞定位试验观察去掉膜定位信号区的MLPK短截体定位情况。将MLPK短截体亚克隆至1391载体后，用EHA105农杆菌侵染洋葱表皮细胞的方法来进行亚细胞定位，在共聚焦显微镜下观察荧光情况。结果表明，融合蛋白GFP-MLPK全长仅在洋葱细胞膜表达，融合蛋白GFP-MLPK核心在细胞核、细胞质、细胞膜均有表达。　　（4）PUB家族基因的挖掘与分析　　利用HMMER软件对PUB保守域序列PF04564进行全基因组检索，使用结构域预测SMART软件分析HMMER软件筛选获得的PUB基因是否包含PUB结构域，利用MEGA进化分析软件对PUB氨基酸序列进行进化分析。本研究鉴定出96个甘蓝PUB成员，101个芜菁PUB成员，70个琴叶拟南芥PUB成员，62个拟南芥PUB成员。根据PUB基因的结构域的组成不同，把甘蓝分成6类，把芜菁分成12类，把琴叶拟南芥分成6类，把拟南芥分成8类。尽管甘蓝PUB家族基因由不同的结构域组成，但是U-box结构域序列较为保守。在甘蓝PUB蛋白进化关系中BoPUB95、BoPUB25、ARC1在一个分支上，其中BoPUB25与ARC1亲缘关系最近，BoPUB30、BoPUB3、BoPUB56、BoPUB43、BoPUB75、BoPUB69在进化上处于同一个分支。　　（5）MLPK诱饵蛋白筛选与其互作的甘蓝PUB家族成员　　筛选与ARC1处于同一分枝的所有的甘蓝PUB序列分别是BoPUB43，BoPUB75，BoPUB30，BoPUB3，BoPUB56，BoPUB69，BoPUB95，BoPUB25。分别构建其短截体，将构建的BoPUB短截体编码序列亚克隆至pGBKT7，用PEG/LiAc法实施转化至AH109酵母感受态，构建的BoPUB短截体均无自激活和毒性，利用MLPK-核心区与PUB基因的臂重复区进行相互作用检测，发现BoPUB43、BoPUB75、BoPUB25的臂重复区可以与MLPK-M3M4互作，其中与BoPUB25互作强度最大。