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自交不亲和性(Self-incompatibility,SI)普遍存在于显花植物中,是植物在长期进化中形成的一种防止自交衰败、保持物种多样性的重要遗传机制。同时,自交不亲和系又是十字花科芸薹属作物杂交育种中重要的亲本材料。因此,深入开展自交不亲和信号传导机理的研究,即可为阐明植物胞间信号传导提供新的内容,也可为生产上利用自交不亲和系配制杂交种提供理论依据。 过去人们普遍认为,十字花科孢子体型自交不亲和柱头内信号传导过程是沿着SRK-ARC1-Exo70A1途径进行,但是近年来的研究表明,在转基因欧洲油菜和琴叶拟南芥中抑制ARC1的表达或者超表达Exo70A1都只能部分打破材料的自交不亲和性,由此说明ARC1-Exo70A1信号通路可能只是SRK下游信号传递途径的一个分支。柱头内可能存在其他的SI信号元件和信号传递分支与ARC1-Exo70A1共同传递来自于SRK的下游信号。 本研究以自交亲和芜菁突变体SCM1和SCM2、自交不亲和甘蓝A4为材料,扩增了SRK、SCR、MLPK、ARC1、Exo70A1基因编码序列,对SI相关基因做了序列和表达分析;成功构建了基于酵母双杂交的MLPK短截体诱饵蛋白,并利用其与ARC1互作验证了MLPK短截体诱饵蛋白可行性。在对甘蓝PUB家族基因全基因组鉴定和分析后,用构建的MLPK短截体诱饵蛋白筛选互作的PUB家族基因。取得了以下结果: (1)甘蓝、芜菁SI元件的克隆与表达分析 以甘蓝A4,芜菁SCM1、SCM2的柱头和花粉cDNA为模版,通过高保真酶扩增三种材料的SRK、SCR、MLPKf1、MLPKf2、MLPKn1、ARC1、Exo70A1的基因,用荧光定量PCR分析这些SI相关基因在三种材料中的表达情况。经序列分析,SCR、ARC1、Exo70A1氨基酸序列在甘蓝和芜菁中具有较高的保守性,甘蓝SRK基因为S28单倍型,存在天然缺失的情况,既可以扩增到基因全长也能扩增到缺失突变体,两种芜菁材料SRK为f2单倍型,既可以扩增到SRK基因全长也能扩增到SRK缺失突变体。芜菁材料MLPK存在关键位点氨基酸突变,194位的甘氨酸G突变为精氨酸R,丧失了自体磷酸化能力。对SI基因的表达情况分析后发现,SI的各种关键元件在甘蓝和芜菁材料中都能正常表达,不同SI元件表达量在不同材料中互有高低。 (2)MLPK诱饵蛋白构建及其与ARC1互作验证 依据蛋白功能域分析,分别构建了MLPK和ARC1短截体,经过对MLPK和ARC1结构域进行生物信息学分析发现,MLPK包含蛋白激酶域;ARC1包含臂重复区、U-box、亮氨酸拉链和卷曲螺旋。MLPK为定位于膜上的受体激酶,为此我们构建了MLPK去掉膜定位序列的短截体,将构建的MLPK短截体亚克隆至pGADT7,将构建的ARC1短截体亚克隆至pGBKT7,用PEG/LiAc法实施转化至AH109酵母感受态,构建的MLPK、ARC1短截体均无自激活和毒性,互作分析表明MLPK-M3M4与ARC1臂重复区互作最强,MLPK-M2M4也能与ARC1臂重复区互作,其他组合均不能互作。 (3)MLPK短截体的亚细胞定位研究 为了分析酵母双杂交检测不到全长MLPK与ARC1相互作用是否与MLPK不能引入细胞核有关。我们通过亚细胞定位试验观察去掉膜定位信号区的MLPK短截体定位情况。将MLPK短截体亚克隆至1391载体后,用EHA105农杆菌侵染洋葱表皮细胞的方法来进行亚细胞定位,在共聚焦显微镜下观察荧光情况。结果表明,融合蛋白GFP-MLPK全长仅在洋葱细胞膜表达,融合蛋白GFP-MLPK核心在细胞核、细胞质、细胞膜均有表达。 (4)PUB家族基因的挖掘与分析 利用HMMER软件对PUB保守域序列PF04564进行全基因组检索,使用结构域预测SMART软件分析HMMER软件筛选获得的PUB基因是否包含PUB结构域,利用MEGA进化分析软件对PUB氨基酸序列进行进化分析。本研究鉴定出96个甘蓝PUB成员,101个芜菁PUB成员,70个琴叶拟南芥PUB成员,62个拟南芥PUB成员。根据PUB基因的结构域的组成不同,把甘蓝分成6类,把芜菁分成12类,把琴叶拟南芥分成6类,把拟南芥分成8类。尽管甘蓝PUB家族基因由不同的结构域组成,但是U-box结构域序列较为保守。在甘蓝PUB蛋白进化关系中BoPUB95、BoPUB25、ARC1在一个分支上,其中BoPUB25与ARC1亲缘关系最近,BoPUB30、BoPUB3、BoPUB56、BoPUB43、BoPUB75、BoPUB69在进化上处于同一个分支。 (5)MLPK诱饵蛋白筛选与其互作的甘蓝PUB家族成员 筛选与ARC1处于同一分枝的所有的甘蓝PUB序列分别是BoPUB43,BoPUB75,BoPUB30,BoPUB3,BoPUB56,BoPUB69,BoPUB95,BoPUB25。分别构建其短截体,将构建的BoPUB短截体编码序列亚克隆至pGBKT7,用PEG/LiAc法实施转化至AH109酵母感受态,构建的BoPUB短截体均无自激活和毒性,利用MLPK-核心区与PUB基因的臂重复区进行相互作用检测,发现BoPUB43、BoPUB75、BoPUB25的臂重复区可以与MLPK-M3M4互作,其中与BoPUB25互作强度最大。