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血吸虫病的发病机制主要是虫卵引发的宿主的肝脏和肠等脏器组织产生肉芽肿病变,并继发纤维化。其实质是由于CD4+T淋巴细胞持续对虫卵抗原发生免疫应答。研究表明,Th1/Th2免疫偏移与血吸虫病虫卵肉芽肿的发生、发展及免疫调节网络密切相关。Th17和Tfh是近年来备受关注的两个新T细胞亚群。已有研究证实ICOSL/ICOS信号在血吸虫导致的慢性炎症及纤维化形成过程中有重要作用。最新研究表明,ICOS的表达与Th17的产生直接相关,亦与Tfh功能密切相关。本课题应用ICOS转基因及ICOSL敲基因小鼠作为血吸虫病实验动物模型,结合体内外实验共同阐明Th17细胞介导的血吸虫卵肉芽肿以及肝纤维化形成的分子机制,并初步探讨ICOSL/ICOS信号对Tfh极化的影响,探索以ICOSL/ICOS信号通路为靶点调节Th17及Tfh极化,下调或控制虫卵肉芽肿反应,抑制或防止肝纤维化的发生与进展,寻找控制血吸虫性肝纤维化的新途径。小鼠感染日本血吸虫病程中Thl7极化相ICOSL-KO/ICOS-Tg关分子的动态变化目的:探讨一、ICOSL-KO/ICOS-Tg小鼠感染日本血吸虫后,ICOSL/ICOS信号的增强或减弱对与Th17极化相关的共刺激分子、转录因子及细胞因子表达水平的影响。方法:在日本血吸虫感染前(0周)和感染早期阶段(4周)、急性病变期(7周)、慢性期(12周)、晚期(16周)应用流式细胞仪检测ICOSL-KO/ICOS-Tg小鼠及其野生型对照小鼠CD4+T淋巴细胞上ICOS、CD 154、IL-17A、RORyt和CD19+B淋巴细胞上ICOSL、CD40、IL-17R的表达水平。应用免疫组织化学方法检测同期ICOSL-KO/ICOS-Tg小鼠及其野生型对照小鼠肝组织IL-17A的表达水平。结果:流式细胞仪检测结果显示:感染日本血吸虫后野生型小鼠脾CD4+T淋巴细胞上ICOS、CD 154以及脾CD19+B淋巴细胞上CD40的表达水平从感染4周后升高,感染12周后达到峰值,随后缓慢下降。ICOSL-KO小鼠脾CD4+T淋巴细胞上ICOS、CD154的表达与同期野生型小鼠相比显著下调,ICOS的表达在感染4周后各病期均显著下调。CD154在感染12周后显著下调。由于ICOSL敲除,在血吸虫感染后各病期CD 19+B淋巴细胞上ICOSL的表达都极低。同时,Th17特异性的转录因子RORyt以及其重要的作用因子IL-17A在ICOSL-KO小鼠的脾CD4+T淋巴细胞上的表达均显著下调;ICOS-Tg小鼠的检测结果则恰好相反。免疫组织化学法检测IL-17A在肝组织的表达水平的结果与流式细胞术的结果一致。结论:ICOSL/ICOS信号的缺失可导致Th17亚群数量及功能的抑制;而加强该信号则诱导免疫应答向Th17偏移。二、日本血吸虫感染ICOSL-KO/ICOS-Tg小鼠致病过程中ICOSL/ICOS信号对Th17极化的影响目的:探讨ICOSL-KO/ICOS-Tg小鼠感染日本血吸虫后,ICOSL/ICOS信号缺失或增强对Thl7极化的影响。方法:收集感染前(0周)和感染后4周、7周、12周、16周、20周的小鼠脾淋巴细胞,与SEA共培养,诱导72小时后收集培养上清,应用ELISA法检测培养上清中Th17型细胞因子IL-17、IL-23、IL-6; Th2型细胞因子IL-4、IL-13、 TGF-β1; Thl型细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-12.结果:Thl型细胞因子IL-2、IFN-y在ICOSL-KO小鼠脾淋巴细胞培养上清中的表达水平与其野生型对照相比呈显著上调;Th2型细胞因子IL-4、IL-13、TGF-β1与其野生型对照相比表达则呈显著下调;Th17型细胞因子IL-17、IL-6、IL-23与其野生型对照相比表达亦呈显著下调。而ICOS-Tg小鼠与其野生型对照相比,其脾淋巴细胞培养上清中Th1细胞因子IFN-y呈显著下调;Th2细胞因子IL-13.IL-4则呈显著上调;Th17细胞因子IL-17亦呈显著上调。结论:进一步证实了感染日本血吸虫后随着病程由急性期转为慢性期,宿主的免疫应答由Thl型逐渐向Th2型转化;同时,也提示,伴随着虫卵肉芽肿形成,下调ICOSL/ICOS信号可导致Th2/Th17免疫应答的减弱,该信号在介导日本血吸虫感染宿主引发的免疫应答中对Th2/Thl7极化的免疫效应可能起到重要作用。三、ICOSL-KO/ICOS-Tg小鼠感染日本血吸虫ICOSL/ICOS信号介导肝虫卵肉芽肿免疫应答及肝纤维化形成中的作用目的:探讨日本血吸虫感染ICOSL-KO/ICOS-Tg小鼠后,ICOSL/ICOS信号缺失或增强对小鼠肝虫卵肉芽肿病变及继发性纤维化发生、发展的影响。方法:观察ICOSL-KO/ICOS-Tg小鼠感染日本血吸虫后肝脾病变及重量的改变;运用HE染色法观察肝脏虫卵肉芽肿病变在ICOSL-KO/ICOS-Tg小鼠中的动态变化;Kaplan-Meier生存分析观察ICOSL-KO/ICOS-Tg小鼠感染日本血吸虫后的生存率。运用Masson染色法观察肝脏纤维化程度在ICOSL-KO/ICOS-Tg小鼠中的变化;应用免疫组织化学法检测ICOSL-KO/ICOS-Tg小鼠肝组织中IL-13、TGF-β1、MMP-9、TIMP-1的表达水平动态变化。结果:免疫组化检测显示,ICOS-Tg小鼠肝组织内均可见明显TGF-β1、IL-13阳性反应,呈片状分布于虫卵肉芽肿内及其周围汇管区、肝血窦,与其野生型对照相比,ICOS-Tg小鼠肝组织TGF-β1、IL-13表达水平显著增强;ICOSL-KO小鼠肝组织内TGF-β1、IL-13阳性反应较少,与其野生型对照相比,TGF-β1、IL-13表达水平显著下降。ICOS-Tg小鼠肝组织内MMP-9、TIMP-1阳性反应呈棕黄色,表达于窦周、汇管区、虫卵肉芽肿纤维组织内,与其野生型对照相比,MMP-9、TMP-1表达水平显著增强;ICOSL-KO组MMP-9、TIMP-1阳性反应较少,与其野生型对照相比,MMP-9、TMP1表达水平显著减弱。另外,ICOS-Tg小鼠肝脾肿大明显,肉芽肿体积增大,纤维化程度更为严重,生存率显著下降;而ICOSL-KO小鼠则均与ICOS-Tg的表现相反。结论:ICOSL/ICOS信号参与了日本血吸虫感染宿主慢性致病过程的病理反应;ICOSL/ICOS信号的减弱或缺失可使血吸虫性肝纤维化进程得到一定程度的抑制。该信号介导的Th2/Th17极化反应与肝虫卵肉芽肿反应和继发性纤维化的发生、发展密切相关。四、体外干预ICOSL/ICOS信号通路对日本血吸虫感染小鼠Th亚群极化的影响目的:探究日本血吸虫感染ICOS-Tg小鼠后,ICOSL/ICOS信号通路对Th17极化的影响及体外干预ICOSL/ICOS信号通路对Th17极化的调节作用。方法:收集感染前(0周)和感染后4周、7周、12周、16周、20周的小鼠脾淋巴细胞,与SEA共培养,并运用ICOS单抗阻断ICOSL/ICOS信号通路,收集培养上清,应用CBA技术(流式细胞仪的液相蛋白定量技术)检测Thl、Th2、Th17型细胞因子。结果:与野生型小鼠相比,ICOS-Tg小鼠产生较高水平的IL-17、IL-4和较低水平的IFN-γ。运用阻断性单抗阻断ICOSL后,ICOS-Tg小鼠脾淋巴细胞培养上清中Thl型细胞因子IFN-y呈显著上调;Th2型细胞因子IL-4、IL-10、IL-13均显著下调,Th17型细胞因子IL-17亦显著下调;阻断ICOS,也发生上述现象。结论:干预ICOSL/ICOS信号能显著降低Th2/Th17型细胞因子的表达,调控免疫偏移的方向。五、ICOS-Tg小鼠感染日本血吸虫病程中ICOSL/ICOS信号对Tfh极化的影响目的:探究日本血吸虫感染ICOS-Tg小鼠后,ICOSL/ICOS信号增强对与Tfh极化相关的共刺激分子、转录因子及细胞因子表达水平的影响。方法:感染日本血吸虫前(0周)和感染后的早期(4周)、急性病变期(7周)、慢性期(12周)、晚期(16周)的ICOS-Tg小鼠及其野生型对照小鼠的CD4+T淋巴细胞经流式细胞仪检测其CXCR5、BCL-6的表达及CXCR5+IL-21+细胞群和CXCR5+CD4+细胞上ICOS、CD40L的表达水平。应用免疫组织化学方法检测同期ICOS-Tg小鼠及其野生型对照小鼠肝组织CXCR5、BCL-6的表达水平。脾淋巴细胞用SEA进行诱导72小时后收集上清,运用阻断性单抗阻断ICOSL/ICOS信号后检测IL-21的表达。结果:流式细胞术检测结果显示日本血吸虫感染后野生型小鼠脾CD4+T淋巴细胞BCL-6、CXCR5+IL-21+细胞群的表达水平以及CXCR5+CD4+T淋巴细胞群上ICOS、CD40L的表达水平从感染4周后升高,感染12周后出现表达水平的峰值,然后缓慢的下降。以上检测指标在ICOS-Tg小鼠中的表达水平与其野生型对照小鼠相比均显著上调。免疫组织化学法检测CXCR5和BCL-6在肝虫卵肉芽肿周围的表达水平的结果与流式细胞术的结果一致。COS-Tg小鼠IL-21的表达水平与同期野生型小鼠相比显著上调;应用ICOSL/ICOS阻断性抗体处理后,IL-21表达水平显著下调。结论:ICOSL/ICOS信号介导的Tfh极化及其功能因子IL-21表达可能参与日本血吸虫感染宿主的免疫应答并与血吸虫感染宿主引发的肉芽肿反应及纤维化的发生发展有关。而CD4+T细胞及其表面CD40L分子也可能在其中起重要作用。综上所述,ICOSL/ICOS信号对日本血吸虫感染宿主慢性致病过程中免疫应答的Th2、Th17以及Tfh极化均可能起到重要作用;并可能以该信号通路为靶点成为调控肝肉芽肿反应及纤维化进程的潜在新途径。