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背景:蛋白质的糖基化是最常见的翻译后修饰,糖基化的类型主要是N位糖基化、O位糖基化、C位糖基化和GPI锚定连接。研究表明在细胞与细胞、细胞与基质间的识别过程中N-糖基化的糖蛋白起到了一定的作用,因此对CD82的N-糖基化修饰在细胞识别与粘附及由此所引发的肿瘤细胞浸润和迁移过程中的作用机制成为本研究的主要出发点。已知CD82是四跨膜糖蛋白,其胞外区有三个N-糖基化的位点,分别为Asn129、Asn157和Asn198位点,以往的研究提示N-糖链对CD82发挥抑制肿瘤转移的作用是必需的。由此我们推测N-糖链可能是CD82与其它分子之间的相互识别、相互作用的重要靶位点,是参与CD82在膜微区正确分布或四跨膜蛋白复合体形成的重要结构。阐明N-糖基化在CD82抑制肿瘤转移过程中的作用可作为临床预测恶性肿瘤患者预后的肿瘤标志物,并为临床探寻阻断肿瘤转移的治疗手段提供理论依据。目的:本研究通过观察CD82不同N-糖基化位点突变体在肿瘤转移过程中细胞生物学行为的改变,初步阐明其调控肿瘤转移的分子机制,并结合动物体内实验进行验证,为肿瘤患者的临床诊断和治疗提供了新的方向。方法:1.构建CD82不同N-糖基化位点突变的突变体,突变位点包括Asn129/Asn157、Asn157/Asn198、Asn129/Asn198双点突变及Asn129/Asn157/Asn198三点突变的突变体,应用慢病毒包装并转染结肠癌细胞SW620,通过q PCR及Western Blot实验检测不同突变体在SW620细胞中的表达水平,另外通过细胞免疫荧光染色检测CD82突变体在细胞中的定位表达情况。2.通过细胞划痕实验、transwell及细胞黏附实验检测CD82不同N-糖基化修饰对细胞运动、迁移及黏附能力的影响。3.检测Wnt信号通路关键分子β-catenin、GSK3β与EMT标志物Vimentin表达情况及磷酸化水平,探究CD82不同N-糖基化突变体在调控肿瘤细胞黏附与转移中的调控机制。4.构建裸鼠体内肺转移模型,研究CD82不同N-糖基化修饰在小鼠体内对肿瘤转移能力的影响。结果:成功构建不同N-糖基化位点突变的CD82突变体,突变位点包括Asn129/Asn157、Asn157/Asn198、Asn129/Asn198双点突变及Asn129/Asn157/Asn198三点突变的突变体,慢病毒包装并转染SW620细胞。以未做转染处理的野生型SW620细胞组为对照组,通过划痕实验和transwell实验发现转染了突变体Asn129/Asn157、Asn157/Asn198和Asn129/Asn157/Asn198的细胞均出现了CD82抑制肿瘤迁移功能的丢失,而在突变体Asn129/Asn198与对照组比较显示SW620细胞保留了野生型CD82具有的抑制肿瘤转移的功能(p<0.0001)。N-糖基化位点突变后细胞的黏附实验显示突变体Asn129/Asn198与对照组比较依旧显示了其保留了野生型CD82的细胞黏附能力(p<0.0001)。在探究CD82不同N-糖基化修饰对Wnt/β-catenin通路的影响显示,突变体Asn129/Asn198同野生型CD82与对照组比较,在SW620细胞中均可见GSK3β的磷酸化被抑制(p<0.01),进而GSK3β促进Wnt/β-catenin信号通路下游重要分子β-Catenin磷酸化而被降解(p<0.01),从而下调Wnt/β-catenin信号通路,抑制细胞EMT转化而使细胞黏附能力增强,迁移能力下降。另外转染突变体Asn129/Asn198的SW620细胞中还出现了Vimentin表达降低,提示细胞的EMT转化受到了抑制(p<0.05)。由尾静脉接种各种N-糖基化突变体转染的细胞株到BLAC/c-Nude小鼠,建立不同N-糖基化突变体细胞株的动物体内肿瘤血道转移模型。结果显示转染了突变体Asn129/Asn198的SW620与野生型CD82的SW620细胞株肿瘤转移数量明显低于其他细胞株。结论:CD82 N-糖基化位点Asn157对维持CD82的肿瘤转移抑制功能起到了重要的作用,可以有效地抑制结肠癌运动迁移及黏附功能。肿瘤转移抑制因子CD82通过Wnt/β-catenin信号通路来调控结肠癌的转移,其中CD82跨膜区域的N-糖基化位点Asn157参与了这一过程并发挥了CD82抑制肿瘤转移的功能。研究表明,CD82 N-糖基化修饰对其发挥肿瘤转移抑制功能有重要的作用,在表观遗传学领域提供了一种新的肿瘤标志物,为肿瘤患者的诊断、治疗及预后提供了新的思路。