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实验目的:研究特异性去泛素化酶USP-25对于巨噬细胞极化的影响,观察敲除或增加USP-25的表达后,M2型巨噬细胞极化发生变化的趋势,从而明确USP-25在巨噬细胞极化方面是起到促炎方面的作用还是抑炎方面作用。同时观察相关细胞产物表达水平变化,以及相关通路信号分子水平变化,探究USP-25影响巨噬细胞极化的作用机制,进一步明确USP-25以及去泛素化作用在免疫调控上的影响和其作用机理。实验方法:1.C57小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM）M2型极化诱导前期参考文献及进行预实验开始提取小鼠骨髓来源原代巨噬细胞并将其往M2型巨噬细胞方向进行极化诱导,通过数次重复实验摸索BMDM向M2型巨噬细胞极化诱导的最适条件[1],确定一个稳定可靠的M-CSF和IL-4或IL-13的诱导体系条件,从而能稳定诱导出足量M2型巨噬细胞,以备后续实验使用。同时熟练掌握提取骨髓来源原代巨噬细胞的方法,为后续的实验打好基础。2.对比野生型小鼠和USP25-/-以及转染干预USP25过表达小鼠M2型巨噬细胞诱导效率和标志物表达水平分别提取野生型C57小鼠和USP25-/-C57小鼠骨髓来源原代巨噬细胞,在已经试验好的相同条件下向M2型巨噬细胞进行诱导,通过流式细胞术检测F4/80和CD206确定M2型巨噬细胞转化效率。提取细胞总RNA和总蛋白进行逆转录、RT-PCR和western b lot检测M2型巨噬细胞标志物Arg-1、f i zz等的表达水平,确定USP25是否会影响M2型巨噬细胞极化诱导及标志物表达。同时对比野生型小鼠及转染干预USP25表达小鼠M2型巨噬细胞辅助验证USP25对于M2型巨噬细胞极化的作用。3.检测观察野生型小鼠和USP25-/-小鼠STAT6、PPAR-γ等通路表达在上述实验步骤取得结果的前提下分别提取RNA及总蛋白进行RT-PCR 和 western-blot 对 STAT6、STAT3、C/EBP β等相关通路分子进行检测,观测通路中关键分子表达水平变化,并对相关表达变化分子进行K48位及K63位泛素化检测,观测表达水平发生变化的分子的泛素化水平是否收到影响,为进一步明确USP25作用位点及作用机制缩小实验范围。4.寻找USP25去泛素化作用位点,明确其作用机制寻找到表达发生改变且K63或K48位泛素化水平发生改变的蛋白后,通过构建含有标签蛋白的载体的方法进行免疫共沉淀,确定USP25是否与该分子存在相互结合作用,从而明确USP25是否通过影响该分子的K48或K63位泛素化水平调控该分子的表达。验证存在相互结合作用后继续进行pull-down或酵母双杂交实验确定USP25是否通过直接与该分子结合逆转泛素化进程降低泛素化水平从而影响相关分子降解或信号传递从而影响通路表达,明确USP25影响巨噬细胞极化的具体作用机制。实验结果:特异性去泛素化酶25（USP25）对于小鼠M2型巨噬细胞极化起到了促进作用,其与M2型巨噬细胞标志物Arg-1的表达呈正相关,当USP25被敲除或抑制表达后,M2型巨噬细胞表达被抑制,其机制与STAT6的泛素化水平调节和表达改水平改变相关。