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以中国农业科学院郑州果树研究所国家种质资源圃葡萄圃的葡萄品种为试材，对葡萄扇叶病毒(GFLV)和葡萄卷叶病相关病毒Ⅲ(GLRaV-Ⅲ)进行了反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测技术研究。采用的技术流程为：通过提取葡萄感病叶片或韧皮部总RNA获得病毒RNA，反转录合成cDNA，经PCR扩增获得病毒cDNA的特征片段，并将其克隆并进行序列分析。本研究对RNA提取方法进行了深入的研究，获得了一种快速简便的提取葡萄组织总RNA的好方法，建立了RT-PCR检测技术规程。现将实验结果归纳如下： 1．提取高质量的RNA是进行RT-PCR检测的基础。酚类化合物、多糖、蛋白质和未知次级代谢产物是影响从葡萄组织提取RNA的几个主要干扰因素。通过对三种提取方法(SDS法、CTAB法和分步离心法)的比较和改进，确立了分步离心法为最佳方法。该法采用磷酸缓冲液，在缓冲液中加入了0.1％2-巯基乙醇，0.15g／100mL BSA，1％的PVP，0.53g Vc／100mL和0.14mol／L NaCl。该法避免了用有机试剂的污染，有效地去除了酚类化合物、多糖、蛋白质和DNA等的污染，在3小时之内可得到高纯度、完整的、适宜进行RT-PCR操作的RNA模板，从而保证了检测的成功。 2．参照已报道的GFLV和GLR_aV-3外壳蛋白基因序列分别设计合成特异引物，采用RT-PCR的方法分别扩增出了722bp和300bp的PCR产物，与预期目的片段一致。 3．为进一步明确PCR扩增的特异性，将PCR产物连接到pGEM-T载体上，转化大肠杆菌E.coli JM109菌株，通过蓝白斑筛选，获得重组质粒，提取质粒DNA，经酶切和PCR对重组质粒进行鉴定，结果证明得到了含有目的DNA片段的重组质粒。对目的片段的序列分析表明GLRaV-Ⅲ的外壳蛋白基因cDNA片段与报道的相应序列具有高度的同源性，其同源率达99.3％。由此证明RT-PCR检测GLRaV-Ⅲ准确可靠，可应用于无毒化栽培的后期检测，对葡萄病毒病的诊断和检疫起重要作用。