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目的：探寻新的小鼠成骨细胞表达的微小核糖核酸（microRNA, miRNA）,并研究其在小鼠不同组织和细胞中的表达模式。方法：提取小鼠成骨细胞小分子RNA,经Poly（A）加尾、连接5’端接头后逆转录为cDNA,进行PCR扩增,回收PCR产物后连接至pcDNA3.1 TOPO载体构建cDNA文库,进行菌落PCR,阳性克隆测序后选取19-26nt大小的RNA进行生物信息学分析确定新的miRNAs。通过Northern blot检测新的miRNA在小鼠成骨细胞、破骨细胞、骨组织、肝脏、心脏、肾脏、肺、脾、大脑、脂肪及骨骼肌的表达,并进一步检测其在BMP-2诱导的小鼠基质细胞ST2成骨分化过程中的表达模式。结果：（1）共克隆得到162个小分子RNA序列,68个为miRNA分子,明确2个为新克隆的miRNA,其中一个命名为miR-X,其在小鼠与人类之间具有保守性,位于小鼠第二染色体。（2） miR-X在小鼠成骨细胞、骨组织及肝脏中均有表达,其中成骨细胞中表达最高,其他组织及破骨细胞不表达。（3）在BMP-2诱导的ST2细胞成骨分化过程中,miR-X随时间延长其表达量不断增加。结论：通过构建小鼠成骨细胞小分子RNA的cDNA文库的方法,新克隆了一个在小鼠与人类存在保守性的新miRNA--miR-X。miR-X在小鼠成骨细胞、骨组织、肝脏中表达,其中成骨细胞中表达最高,并且在小鼠成骨细胞分化过程中的表达呈时间依赖特性。目的：研究miR-X在小鼠基质细胞ST2成骨分化中的作用并预测及实验验证miR-X的靶基因。方法：根据miR-X前体序列设计引物,经退火处理后与线性化的pSilencer 4.1CMV puro载体连接,构建miR-X表达载体pre-miR-X。将pre-miR-X或2’-O-methyl修饰的反义寡核苷酸anti-miR-X分别转染BMP-2诱导分化的ST2细胞（300ng/ml）,造成miR-X在成骨分化过程中的过表达或功能抑制。转染48小时后,采用分光光度计检测对硝基苯酚释放来反映碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）活性,放射免疫测定法测定骨钙素（osteocalcin, OC）分泌,采用Western blot和实时定量PCR检测转录因子runt相关转录因子2 （runt related transcription factor 2, Runx2）蛋白和mRNA表达的变化。采用多种靶基因预测软件预测miR-X的靶基因。PCR扩增含靶位点的靶基因编码区（coding sequence, CDS）,产物连接pGL3载体,构建野生型Hoxa2CDS荧光素酶报告基因载体,采用定点突变技术构建突变型Hoxa2CDS荧光素酶报告基因载体,分别与miR-X表达载体共转染BMP-2诱导的ST2细胞,通过荧光素酶活性变化证实Hoxa2是否为miR-X靶基因。将miR-X表达载体单独转染ST2细胞,采用Western blot和实时定量PCR检测Hoxa2蛋白和mRNA水平的变化,验证miR-X对Hoxa2的调控作用。结果：（1）miR-X过表达促进BMP-2诱导的ST2细胞成骨分化过程中的ALP活性增高和OC分泌,并增加Runx2 mRNA和蛋白的表达。（2）抑制miR-X的作用降低了ST2成骨分化过程中的ALP活性及OC分泌的上升程度,并部分抑制Runx2 mRNA和蛋白的表达。（3）Rnas22预测Hoxa2为miR-X的靶基因。（4）与对照组相比,共转染野生型Hoxa2 CDS荧光素酶报告基因载体及miR-X表达载体的ST2细胞荧光素酶活性显著下降,而共转染突变型Hoxa2 CDS荧光素酶报告基因载体及miR-X表达载体的ST2细胞荧光素酶活性无明显变化。（5）转染miR-X表达载体的ST2细胞Hoxa2蛋白水平下降,但Hoxa2 mRNA表达无明显变化。结论：miR-X在转录后水平抑制靶基因Hoxa2,增加转录因子Runx2的表达,从而促进BMP-2诱导的ST2细胞的成骨分化。目的：探索两个新克隆的miRNA, miR-X和miR-2861之间的关系及其与转录因子Runx2的相互作用。方法：通过BLAST等生物信息学方法寻找miR-X与miR-2861在基因组上的定位,分析两者之间的位置关系,采用Mfold软件预测初级转录本（primary microRNA, pri-miRNA）的二级结构。通过国外公布的人类及小鼠转录起始位点（TSS）预测文库,根据第四位赖氨酸三甲基化的H3组蛋白（H3K4me3）在TSS位点周围的富集与启动子CpG岛为主要标识,预测miR-X/miR-2861表达簇的TSS。运用TF-seach转录因子结合位点预测软件分析miR-X/miR-2861表达簇的TSS上游2kb内的DNA序列,预测可能的Runx2结合位点。通过染色体免疫沉淀法（ChIP）,采用Runx2抗体（anti-Runx2）验证Runx2与所预测结合位点的相互关系。通过PCR扩增Ⅱ型Runx2 cDNA并亚克隆至pSG5载体,构建Runx2表达载体pSG5-Runx2,转染ST2细胞,并将体外合成的特异性阻断Runx2蛋白表达的小干扰RNAsiRNA-Runx2,转染BMP-2诱导的ST2细胞,分别采用Northern blot检测miR-X和miR-2861的表达,研究Runx2对miR-X与miR-2861表达的调控作用。结果：（1） miR-X与miR-2861在小鼠第2染色体上的基因定位仅相差69bp,两者以miR-X/miR-2861表达簇的形式存在。（2）确定miR-X/miR-2861表达簇的转录起始位点位于小鼠第2染色体10,104,622。（3）预测Runx2在]miR-X/miR-2861表达簇启动子的转录结合位点在其TSS上游2kb。（4） ChIP证实Runx2结合于所预测的转录因子结合位点。（5）与对照组细胞相比,转染Runx2表达载体的ST2细胞中,miR-X与miR-2861的表达增强。而转染siRNA-Runx2的BMP-2诱导ST2细胞miR-X与miR-2861的表达降低。结论：miR-X与miR-2861在基因组中成簇存在,共同转录。转录因子Runx2通过与miR-X/miR-2861表达簇的启动子结合,促进表达簇的转录,并与miR-X和miR-2861形成正反馈调控环路,协同调控成骨分化。