介绍：　　乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,是一种多发因素的疾病，根据其分型和分期不同，影响预后。近几年医学研究的快速发展，极有效地提高了人们对乳腺癌的认知，并且为乳腺癌治疗策略开辟新的途径。虽然临床上提倡早期发现、早期治疗，然而目前乳腺癌总生存率依然不容乐观。近年来随着对乳腺癌的病因和病程发展的研究不断深入，临床和基础领域不断有新的发现，Notch信号通路是一种进化上保守的信号通路，它在调控细胞的特异性、分化、增殖以及维持干细胞的干性中发挥着不可替代的作用。通过与邻近细胞上的配体结合，Notch受体被激活，并继发引起下游基因激活。在这个过程中，Notch-ICD的及时的激活和失活，对于Notch信号的精确调控，以及对于维持细胞正常功能是至关重要的。Notch通路在乳腺癌中起重要作用。我们实验室之前的研究结果证明，Notch3在乳腺癌细胞上皮细胞-间质转化中起着重要作用，但其自身调节的机制仍不清楚。前期研究已经表明，Notch是一种相对短命的蛋白质，家族中多数成员主要通过泛素-蛋白酶体这一方式降解，而E3在对蛋白质底物的高选择性中发挥着关键的角色，目前研究关于靶向Notch3降解的特异性E3连接酶尚未明确。　　材料与方法：　　采用放线菌酮处理不同的乳腺癌细胞，通过阻断蛋白质合成来监测Notch3蛋白降解情况，并计算半衰期。通过蛋白酶体抑制剂（目前实验使用较多见的MG132）或者溶酶体抑制剂氯化铵来检验Notch3的蛋白聚集情况，用以判断Notch3可能的降解途径。在细胞培养的基础上，我们使用人为构建的反映Notch通路的报告基因系统,联合E3连接酶的RNAi文库，由此所得的报告基因的活性来反应Notch的蛋白水平。通过汇集针对不同E3连接酶基因的siRNA序列，在细胞培养系统中，快速进行E3连接酶的高通量筛选。特异性E3连接酶靶向调节Notch3蛋白的泛素化过程被抑制，从而改变通路活性，通过报告基因系统间接反映E3对于Notch3的影响。并且在初步筛查结果中，挑选出可能的分子，再进一步进行免疫印迹、实时荧光定量、免疫共沉淀实验操作，来证明该分子和Notch3的关系。　　结果：　　在乳腺癌细胞中，泛素-蛋白酶体系统参与到MCF7内源性Notch3以及MDA-MB-231稳定表达Notch3的细胞中Notch3的降解。对43个E3连接酶筛查结果分析，初步得到5个Notch特异相关的E3连接酶备选基因，其中大于2倍增幅的基因有一个，增幅小于2大于1.5的基因有4个。进一步实验验证，在乳腺癌细胞中存在着WWP2对Notch3的呈负性调控关系。并且WWP2可以缩减Notch3的蛋白半衰期。此外，外源性表达的Notch3在MDA-MB-231-N3ICD细胞株中与WWP2之间有相互结合关系。　　结论：　　采用泛素连接siRNA文库结合荧光素酶报告基因系统在筛选出潜在的能影响Notch3蛋白水平的特异性的泛素连接酶，并进一步验证在乳腺癌MCF-7细胞中WWP2对于Notch3在蛋白水平上的负性调控，以及外源性的Notch3在MDA-MB-231-N3ICD细胞内存在与WWP2的相互结合。