2016年四川省某养殖场虹鳟幼鱼疑似传染性造血器官坏死病毒(Infectious Hematopoietic Necrosis Virus,IHNV)感染,本研究通过RT-PCR、细胞培养、序列分析以及人工感染试验初步判定该病毒为IHNV。在此基础上,克隆表达了IHNV的基质蛋白基因(Matrix protein,M),并对其进行了Western blot检测和生物信息学分析,以表达出来的M蛋白刺激虹鳟头肾单核/巨噬细胞并注射入健康虹鳟体内,以探讨M蛋白对免疫相关基因的影响。具体研究结果如下:1一株虹鳟源传染性造血器官坏死病毒的分离鉴定2016年四川省成都市大邑某虹鳟养殖场暴发以体色发黑,眼球突出等为特征的急性传染病,稚鱼死亡率高达80%。针对常见的鲑鳟鱼病毒性传染病,对送检病鱼进行RT-PCR检测,检测后测序结果同GenBank进行Blast比对。取待检病鱼的肾脏和脾脏组织研磨,反复冻融三次以后取上清接种于胖头鱥肌肉细胞(Fathead monnow cell line,FHM),观察细胞变化。待细胞病变后,收集细胞病毒液,腹腔注射健康虹鳟稚鱼,观察死亡率情况。设计IHNV G蛋白基因,克隆到T载体上,测序后构建系统发育树分析其基因型。结果显示病鱼PCR结果呈现阳性,测序后同GenBank进行Blast比对,扩增序列同IHNV核蛋白基因具有99%的同源性。病鱼组织上清接种细胞盲传三代均出现典型的细胞病变效应(CPE)。人工感染试验注射病毒液组14天内表现出86.67%的死亡率,且死亡虹鳟与自然发病的虹鳟症状一致,均表现出体色发黑,眼球突出等症状,而对照组虹鳟则无异常。本节成功从患病虹鳟中分离到了致病性病原—IHNV,并通过人工感染实验和RT-PCR进一步确定了该病原为传染性造血器官坏死病毒。2传染性造血器官坏死病毒M蛋白的克隆和表达及生物信息分析以传染性造血器官坏死病毒基因组为模板,克隆基质蛋白基因序列。使用生物信息学软件分析M蛋白核苷酸序列,结果表明M蛋白大小为585bp,编码195个氨基酸,包含一个完整的开发阅读框,蛋白大小为21.9 kDa。此外,M蛋白有一个名为Rhabdo_matrix的保守结构域,同狂犬病毒M蛋白基因类似,且M蛋白不含信号肽和跨膜区,疏水性大于亲水性。系统发育分析表明M蛋白同我国IHNV HLJ-09株聚为一簇,均为JRt基因型。通过原核表达获得的纯化M蛋白,并对其特异性进行分析。结果显示,诱导温度为37℃,异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside,IPTG)浓度0.1 mM,诱导时间为4 h时重组M蛋白表达在沉淀中,蛋白大小约为38 kDa,Western-blotting结果表明重组M蛋白具有较好的特异性。3传染性造血器官坏死病毒M蛋白对免疫相关基因的影响为了研究M蛋白的对免疫相关基因的影响,我们将上述表达的蛋白刺激虹鳟原代头肾单核/巨噬细胞4 h、8 h、12 h和24 h后,各个时间点分别收集细胞提取核糖核酸(Ribonucleic acid,RNA),qPCR分别检测主要组织相容性复合体II(Major Histocompatibility Complex II,MHC IIβ),主要组织相容性复合体I(Major Histocompatibility Complex I,MHC I),白细胞介素-1β(Interleukin 1β,IL-1β),肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factorα,TNFα),干扰素(Interferon I,IFN-I),干扰素调节因子I(IFN regulatory factor 1,IRF1),CD4和CD8的表达量。结果显示基质蛋白可以抑制上述八个基因表达量的上升。此外,将表达基质蛋白免疫健康的虹鳟8h、1 d、3 d、1 w和2 w后,各个时间点摘取其头肾组织提取RNA,qPCR分别检测MHCII,MHCI,IFN-I,IRF1,CD4,CD8,IL-1β和TNFα的表达量。结果显示M蛋白也可以抑制上述八个基因的表达水平。