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肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)目前是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,流行病学数据显示,目前全球每年肝癌致死约有近50万人,排列癌症死亡原因的第二位。中国作为肝癌发病率较高的国家,患病人数每年呈上升趋势。尽管随着医疗技术的发展进步,肝癌的相关诊断和治疗技术方案等已经有了长足进步,中国地区肝癌患者的术后生存率已经得到显著提升,尽管如此,由于肝癌的病程进展具有速度快、高转移、高复发的特点,导致了国内肝癌患者的总体生存率仍然不理想。因此,通过对肝癌转移和复发的分子机制进行探索,深入探究肝癌的侵袭转移与患者预后的相关核心分子,从而开发针对肝癌发病、转移和复发的有效的靶标分子,有望为临床工作中降低肝癌复发率和病死率的研究提供实验依据。已有研究发现,RASSF6蛋白在多种细胞中均有高强度表达,针对RASSF6蛋白功能的研究显示,通过基因转染实现过表达RASSF6可有效地抑制多种癌细胞的增殖和转移。目前可以确定的是,RASSF6是肿瘤细胞增殖和转移过程中关键调控蛋白之一。RASSF6已有大量研究证实,其与结肠癌、白血病、鼻咽癌和肾癌的恶性生物学行为有关。但是对于RASSF6在肝癌中的作用及其机制尚未有研究报道。【目的】1、检测临床肝癌样本和对应癌旁组织中RASSF6的表达,分析RASSF6的表达与肝癌患者临床指标的关联性。2、探索RASSF6蛋白对肝癌细胞增殖、凋亡和侵袭转移能力的调控作用。3、探讨RASSF6蛋白在调控肝癌细胞恶性生物学行为的具体机制。【方法】1、采用Realtime PCR和western blot检测32例临床肝癌组织和对应癌旁组织中RASSF6的表达情况,收集患者的临床病例资料并进行关联性分析;并分析人肝癌细胞系HepG2,SMMC-7721,MHCC-97H和人肝细胞HL-7702细胞中RASSF6的表达情况;2、构建RASSF6过表达质粒载体,转染人肝癌细胞系HepG2提高其RASSF6的表达水平。采用CCK-8、Transwell侵袭、流式细胞术、迁移实验和裸鼠皮下瘤移植实验检测RASSF6对肝癌细胞增殖、凋亡以及侵袭、转移能力的影响。3、构建RASSF6过表达质粒载体,转染人肝癌细胞系HepG2提高其RASSF6的表达水平。采用FAK抑制剂抑制FAK蛋白表达,检测其对肝癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移能力的影响,深入探索RASSF6相关的分子机制。【结果】1、肝癌组织中RASSF6 mRNA的表达水平下降至0.365±0.042倍,与癌旁组织相比,差异有统计学意义(P<0.05)。western blot检测结果与此趋势一致,肝癌组织中RASSF6的蛋白表达水平下降至0.215±0.019倍,显著低于癌旁组织。在不同的肝癌细胞系中,RASSF6的表达存在不同;与HL-7702人肝细胞相比,HepG2,SMMC-7721和MHCC-97H肝癌细胞中RASSF6 mRNA和蛋白的水平显著降低(p<0.05),其中HepG2细胞中RASSF6 mRNA和蛋白的水平最低。2、肝癌组织中RASSF6 mRNA的相对表达水平与肝癌患者的HBs Ag、肿瘤体积、TNM分期、病理分级程度、是否有癌栓以及复发等显著相关(P<0.05),而RASSF6 mRNA的相对表达水平与患者的年龄、性别、血清AFP水平、有无包膜以及肿瘤分化程度等无关(P>0.05)。而在32例肝癌患者的癌旁组织中RASSF6mRNA的相对表达水平与肝癌患者临床指标均无显著关联性(P>0.05)。3、转染pcDNA3.1-RASSF6后,HepG2肝癌细胞中RASSF6的表达水平出现显著上调。转染pcDNA3.1-RASSF6后肝癌HepG2细胞增殖能力明显低于阴性对照组细胞(P<0.05),并且随着作用时间的增加,细胞增殖能力下降更加明显。流式细胞术检测结果显示,转染pcDNA3.1-RASSF6后肝癌HepG2细胞的凋亡比例显著提高至15.69±1.78%,与阴性对照组细胞的凋亡率(5.62±0.55%)相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。Transwell实验结果显示,过表达RASSF6后,肝癌HepG2细胞迁移通过聚碳酸酯膜小室能力显著下降,过表达RASSF6的HepG2细胞转移数量出现下降(P<0.05)。与阴性对照组细胞相比,过表达RASSF6的HepG2细胞的侵袭细胞数量显著下降(P<0.05)。转染pcDNA3.1-RASSF6的HepG2细胞中E-cadherin表达显著增加,而N-cadherin表达显著下降。体内实验结果显示,两组裸鼠的皮下肿瘤体积和重量均随着时间延长而增加,其中过表达RASSF6的肝癌HepG2细胞所形成的肿瘤体积小于阴性对照组细胞,从第10天开始,差异具有统计学意义,至第25天实验结束时,pcDNA3.1-RASSF6组肿瘤体积为401.3±43.9mm~3,显著小于阴性对照组(956.4±93.4mm~3,p<0.05)。经统计分析,pcDNA3.1-RASSF6组细胞形成的裸鼠皮下肿瘤重量为0.647±0.055g,而阴性对照组细胞形成的皮下肿瘤重量为0.212±0.019g(P<0.05)。4、过表达RASSF6后肝癌HepG2细胞中FAK蛋白的磷酸化水平显著降低(与阴性对照组相比,P<0.05),同时MMP-2和MMP-9蛋白的表达也出现了显著降低,表明RASSF6能够负向调节FAK通路的激活。使用FAK蛋白抑制剂PF-562271抑制FAK蛋白活性,检测肝癌HepG2细胞的功能改变。CCK-8增殖实验结果显示,PF-562271抑制FAK蛋白活性后,肝癌HepG2细胞的增殖能力显著降低(与对照组相比,P<0.05)。而且RASSF6过表达的肝癌Hep G2细胞中,增殖能力进一步降低(与转染组和PF-562271组相比,P均<0.05)。与对照组相比,PF-562271抑制FAK蛋白活性后,肝癌HepG2细胞的侵袭能力均显著减弱(P<0.05),而且在RASSF6过表达的肝癌细胞中,侵袭能力进一步降低(P<0.05)。流式细胞术结果显示,PF-562271抑制FAK蛋白活性后,肝癌HepG2细胞的凋亡水平显著增加(P<0.05),而且在RASSF6过表达的肝癌细胞中,细胞凋亡比例进一步显著增加(P<0.05)。以上结果表明,FAK蛋白可能是RASSF6调控的靶点蛋白。通过western blot检测了FAK蛋白抑制剂PF-562271对肝癌HepG2细胞中与细胞增殖、侵袭和凋亡相关蛋白的影响。与对照组相比,PF-562271抑制FAK蛋白活性后,肝癌HepG2细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2表达下降,凋亡相关蛋白Bax表达增强,侵袭相关蛋白MMP-2和MMP-9表达下降(P<0.01),而且在RASSF6过表达的肝癌细胞中,上述蛋白的表达改变进一步显著增加(P<0.05)。以上结果表明,RASSF6可能通过调控增殖、凋亡和侵袭相关蛋白的表达抑制肝癌细胞的恶性表型。【结论】1、RASSF6在三种人肝癌细胞系中和临床肝癌组织中存在显著的低表达,并且RASSF6的表达水平与患者的临床指标密切相关;2、RASSF6表达增强能在体外和体内抑制肝癌细胞的增殖、侵袭和转移能力,并促进肝癌细胞凋亡3、FAK是RASSF6调控的下游靶基因,RASSF6能够通过抑制FAK通路的激活来抑制肝癌细胞的增殖、侵袭、转移能力并促进肝癌细胞凋亡,并能够调控相关功能蛋白的表达。因此,RASSF6蛋白有可能成为肝癌治疗的潜在靶点。