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目的:真核翻译延伸因子2(EF2)是我们实验室应用荧光差异双向凝胶电泳(2DDIGE)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)筛选出来的在肺鳞癌患者癌组织与癌旁组织之间表达差异性蛋白,其在肺鳞癌患者癌组织中表达较高,在癌旁组织中表达较低。目前,国内外关于EF2与肿瘤关系的研究主要集中在差异蛋白表达水平的检测,关于EF2推动肿瘤发展的明确机制尚不清楚。实验室前期工作中,利用双荧光素酶报告基因检测常用的工具细胞293T细胞,结果发现EF2可能激活STAT信号转导通路。因此,我们提出一个科学设想:EF2是否通过STAT通路促进癌细胞向更为恶性的表型发展。本研究将外源性EF2基因转染到人宫颈癌Hela细胞系和肺鳞癌H520细胞系中,探究EF2对STAT信号通路的影响及作用机制,从而了解EF2在肿瘤发展过程中发挥的可能功能,探讨通过阻滞STAT通路是否可以抑制EF2的促癌作用,为肿瘤的治疗提供新的思路和方法。方法:(1)细胞系的选择与EF2高表达及敲降细胞系的构建:选择Hela细胞与H520细胞构建EF2高表达和敲降的细胞系,分别验证高表达及敲降效率。(2)EF2对STAT通路中关键蛋白STAT1、STAT3磷酸化的影响:瞬时转染EF2,48小时后收集细胞,提取总蛋白,利用Western blot法检测STAT通路中STAT1、STAT3磷酸化蛋白的表达变化。(3)EF2对Phospho-STAT1(Tyr701)(以下简写为p-STAT1(Tyr701))、Phospho-STAT3(Y705)(以下简写为p-STAT3(Y705))蛋白表达及亚细胞定位的影响:免疫荧光,核质分提法检测EF2是否促进p-STAT1(Tyr701)、p-STAT3(Y705)入核发挥转录因子作用。(4)EF2是否激活STAT3上游激酶JAK2:EF2高表达和敲降后,利用Western blot法检测JAK2总蛋白及磷酸化蛋白的表达变化。(5)阻滞JAK2/STAT3通路对EF2定位的影响:在Hela细胞中加入JAK2/STAT3通路抑制剂,Western blot检测核质分提蛋白里EF2在细胞核和细胞质里的表达。(6)凋亡表型的检测:DAPI染色、流式细胞术检测EF2对细胞凋亡的影响。(7)EF2对JAK2/STAT3通路下游凋亡靶基因Bcl-xl、Bcl2的影响。EF2高表达和(或)敲降,q PCR和Western blot法检测JAK2/STAT3通路下游靶基因Bcl-xl、Bcl2的表达。结果:(1)选择Hela细胞和H520细胞作为研究对象,EF2高表达和敲降细胞系均建立成功。(2)EF2激活STAT通路:Western Blot结果显示EF2影响p-STAT3(Y705)、p-STAT1(Tyr701)蛋白的表达。即在EF2高表达的细胞系中,p-STAT3(Y705)、p-STAT1(Tyr701)的表达增加,差异具有统计学意义(p<0.05);在EF2敲降的细胞系中,p-STAT3(Y705)、p-STAT1(Tyr701)的表达降低,差异具有统计学意义(p<0.05)。(3)核质分提和免疫荧光实验结果显示EF2促进p-STAT1(Tyr701)蛋白入核,抑制p-STAT3(Y705)蛋白入核。(4)EF2激活STAT3上游激酶JAK2:Western blot结果显示EF2高表达后,JAK2、p-JAK2表达增加,差异具有统计学意义(p<0.05);EF2敲降后JAK2、p-JAK2表达降低,差异具有统计学意义(p<0.05)。(5)阻滞JAK2/STAT3通路降低了EF2在细胞质和细胞核内的表达:在Hela细胞中加入JAK2/STAT3通路抑制剂AG490,Western blot结果显示EF2在细胞质和细胞核里的表达降低。(6)DAPI染色、流式细胞术检测结果显示EF2对Hela细胞凋亡有一定抑制作用。(7)EF2增加了JAK2/STAT3通路下游凋亡靶基因Bcl-xl表达。a.q PCR结果显示,EF2高表达后,Bcl-xl m RNA表达增加,Bcl2 m RNA表达无明显变化。b.Western blot结果显示在EF2敲降的细胞系中,Bcl-xl表达降低。结论:1.EF2激活了STAT信号转导通路。2.阻滞JAK2/STAT3信号通路抑制了EF2在细胞质和细胞核里的表达。3.EF2抑制肿瘤细胞凋亡。4.EF2促进了Bcl-xl的表达。