灵芝是一种珍贵的药用真菌，已有几千年的应用历史，具有广泛的药理作用，如抗肿瘤，抗HIV病毒，免疫调节等。以往研究表明包括灵芝酸在内的三萜类化合物是灵芝中的主要生理活性成分之一。但是，天然的灵芝子实体中，灵芝酸含量较少。本实验室在灵芝菌丝体发酵高效生产灵芝酸等代谢产物方面，有良好的研究积累和技术优势。本论文对灵芝酸的分离纯化和抗癌活性及机理进行了探索，以期对灵芝类药用真菌的现代化研究提供技术支持和理论基础。 由于灵芝酸分子中含有不饱和键，性质较不稳定。在灵芝酸的分离纯化过程中，本论文采用联用技术建立了一种高效液相色谱和质谱以及紫外检测器耦联(HPLC-UV-MS)的快速有效的分离方法，缩短了分离纯化时间并达到了定向分离的目的。通过优化色谱条件，各个色谱峰达到了基线分离。应用建立的色谱优化条件，检测了几种灵芝酸的存在、分布和部分结构信息。同时，利用制备色谱从发酵培养的灵芝菌丝体中分离得到了纯度大于99﹪的两种灵芝酸单体。根据UV，IR，MS，1HNMR和13CNMR进行结构鉴定，它们分别为已报道过的灵芝酸Me(GA-Me)和灵芝酸T(GA-T)。进一步对这两种灵芝酸进行量子化学分析，比较其分子的空间结构和能量分布差别，结果表明两种分子的空间结构和能量分布没有显著差异，提示它们在功能及作用机理上可能是相似的。本实验中，在15-55℃的范围内，对灵芝酸T和Me在C18分析柱表面的热力学保留行为进行了研究。结果显示灵芝酸在RP-HPLC中的保留行为可能是受焓变(△H)驱动的。 通过四氮唑(MTT)法研究了灵芝酸单体对多种癌细胞株和正常细胞株增殖的影响。结果表明，两种灵芝酸对肿瘤细胞和正常细胞有不同的细胞毒性。在实验浓度范围内，灵芝酸对癌细胞的增殖抑制作用呈剂量依赖性，而对正常细胞的抑制率较低。这提示灵芝酸可以在一定的对正常细胞无影响的浓度范围内，发挥其抗癌活性，对癌细胞可能具有靶向抑制作用。动物体内实验表明：灵芝酸能抑制裸鼠体内实体瘤的增殖，具有浓度依赖性。同时，灵芝酸T和Me联合作用对高转移肺癌细胞株(95-D)的细胞毒性没有表现出协同作用或拮抗效果，推测这两种化合物的作用机理可能是相同的。 进一步研究表明，灵芝酸T是通过诱导凋亡的方式来抑制癌细胞增殖。在实验中，观察到了癌细胞的DNA片段化，线粒体的膜电位下降，细胞色素c从线粒体内释放出来。此外，Caspase-8的活性没有发生显著的变化，而Caspase-3的活性快速增加。还同时观察到了p53表达量的增加，Bax表达量的上调，而Bcl-2的表达量没有发生变化。综合以上结果可以推断，灵芝酸抑制高转移肺癌细胞增殖主要是通过细胞内与p53相关的线粒体途径来实现的。GA-Me具有相似的作用效果。 癌细胞中拓扑异构酶是抗癌药物的一个作用靶点。实验发现，灵芝酸T能够抑制高转移肺癌细胞内的拓扑异构酶I活性，这种抑制表现出药物浓度依赖性。以灵芝酸T对拓扑异构酶I与超螺旋DNA的作用，探讨了灵芝酸的作用方式。结果表明：灵芝酸T可以抑制酶－底物复合物的形成，这种抑制是通过直接与超螺旋DNA相互作用，形成开环DNA，改变了底物的状态。原子力扫描电镜(AFM)图像也进一步证明了这一点。因此，灵芝酸抑制拓扑异构酶I具有催化型抑制剂的典型特征，属于催化型抑制剂。 化疗药物的耐药性是导致癌症治疗无效的常见原因，因此寻找新的同时具有抗肿瘤和增敏增效作用的抗癌药物的先导物已成为肿瘤化疗中急需解决的问题。本文研究了灵芝酸增加多药耐药性细胞株(KB-A-1)对阿霉素的敏感性的可能性及其可能的作用机理，结果表明，灵芝酸在相对较高的浓度条件下对阿霉素敏感和不敏感的癌细胞株都有较强的细胞毒性，阿霉素诱导出的多药耐药性并未影响到灵芝酸对癌细胞的抑制作用。在较低的浓度条件下，灵芝酸可以逆转阿霉素诱导出的多药耐药性，使癌细胞对阿霉素的敏感性增加。进一步研究表明，灵芝酸处理后，多药耐药性细胞株对阿霉素的吸收量增加。通过对Rhodanmin123的吸收实验表明，灵芝酸处理可能影响到细胞中药物传递系统的活性。动物实验表明：灵芝酸能抑制裸鼠体内多药耐药性实体瘤的增殖并增加对其阿霉素的敏感性，阿霉素和灵芝酸的混合使用并没有引起动物死亡，表明灵芝酸并没有增加化疗药物的毒副作用。 综上所述，本研究成功地从灵芝发酵菌丝体中分离纯化出两种灵芝酸单体GA-Me和GA-T，它们具有通过诱导凋亡的方式来抑制肿瘤增殖的活性，诱导癌细胞的凋亡是通过线粒体途径来实现的，抑制拓扑异构酶I的活性可能是其诱导凋亡的原因。同时，灵芝酸对多药耐药性细胞表现出增敏增效作用。由此，推断其有望成为一种有效的肿瘤抑制剂。