论文部分内容阅读
本研究分为三部分：
第一部分：鞘内注射利多卡因对慢性坐骨神经压迫模型大鼠神经病理性疼痛的治疗作用
目的：采取主动性鞘内注射大剂量的利多卡因，可治愈顽固性、难治性疼痛。但目前，此方法仍存在很多尚未明确的问题，如治疗时药物的最佳剂量，其疗效维持时间等。本课题拟应用慢性坐骨神经压迫损伤大鼠模型(Chronicconstrictioninjury，CCI)，比较不同剂量利多卡因对慢性压迫性损伤模型大鼠的热痛敏和触觉异常疼痛的作用，确定有效药物剂量范围，治疗后的疗效及疼痛缓解时间，探讨鞘内注射利多卡因疗法的最佳模式和治疗效应，为其在临床上的安全应用提供参考.
方法：健康清洁级成年雄性SD大鼠，随机分为10组：其中8组大鼠均接受CCI手术，在CCI手术后7天，分别接受鞘内注射0.9％生理盐水(saline组)，或不同浓度的利多卡因注射组(2，4，6.5，10，15，25，和35mg/kg)。正常组和正常对照组不行CCI手术，其中一组接受鞘内25mg/kg利多卡因注射。观察各组术前(baseline)，CCI术后(CCI1天，3天，6天)，鞘内注射利多卡因(Singleintrathecallidocaine，SIL)1天，2天...10天的触觉缩爪阈值(VonFreywithdrawalthreshold，PWT)和热潜伏缩爪阈值(ThermalPawWithdrawallatency，PWL)改变。正常组和正常对照组行FJB染色。术中记录其血压、心率、呼吸等指标的变化。
结果：大鼠CCI术后6天PWT和PWL明显下降，接受鞘内注射利多卡因后，6.5mg-35mg组热痛敏异常明显缓解，并呈现剂量相关，可持续2-8天，但是2mg和4mg组没有明显效果。15，25，35mg/kg组可以明显减轻CCI大鼠的触觉异常疼痛。正常组和正常对照组的PWT和PWL以及FJB染色没有差异。
结论：鞘内注射利多卡因可以明显抑制大鼠由CCI手术所引起的神经痛，考虑到利多卡因的有效性以及不良反应，最佳有效剂量应为15-25mg/kg。
第二部分：抑制小胶质细胞p38MAPK磷酸化是鞘内注射利多卡因治疗CCI大鼠神经病理性疼痛的重要机制
目的：第一部分实验发现，鞘内注射15-25mg/kg利多卡因可以明显抑制大鼠CCI手术所引起的神经痛，但其机制尚不明确。目前，在多种疼痛模型上发现，神经损伤后脊髓的小胶质细胞磷酸化p38有丝分裂原激活蛋白激酶(p38mitogen-activatedproteinkinase；p38MAPK)免疫反应阳性成分明显增加，而鞘内给予p38MAPK抑制剂可以减轻伤害感受性行为学变化。这些研究均提示了脊髓小胶质细胞p38MAPK在痛觉过敏的产生过程中发挥重要作用。本研究应用免疫荧光和蛋白免疫印迹技术法研究鞘内注射利多卡因与脊髓小胶质细胞的p38MAPK信号通路之间的关系。
方法：健康清洁级成年雄性SD大鼠.随机分为4组：Norm组(正常大鼠)，CCⅠ组(单纯行CCI神经痛手术)，CCI+0.9％NaCl组(CCI后7天，鞘内注射0.5ml0.9％NaCl)，CCI+25mg/kg利多卡因组(CCI后7天，鞘内注射0.5ml25mg/kg利多卡因).①对CCI神经痛模型大鼠LA-5脊髓冰冻切片行免疫荧光染色，将磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)抗体与小胶质细胞特异标记物OX42抗体，或神经元特异标记物NeuN抗体，或星型胶质细胞特异标记物GFAP抗体共标，观察p-p38MAPK在CCI神经痛模型的大鼠脊髓各种细胞上的表达情况。应用蛋白免疫印迹技术，观察CCI术后大鼠L4-5脊髓p-p38MAPK蛋白表达的变化。②鞘内注射利多卡因术后4天，用免疫荧光染色方法和蛋白免疫印迹技术观察各组大鼠p-p38MAPK蛋白表达情况.
结果：①CCI神经痛模型可引起大鼠L4-5脊髓p-p38MAPK蛋白表达明显增加；p-p38MAPK抗体与小胶质细胞特异标记物OX42，神经元特异标记物NeuN，或星型胶质细胞特异标记物GFAP共标结果显示，p-p38MAPK和OX42共定位良好，说明坐骨神经压迫性损伤手术引起L4-5脊髓p-p38MAPK蛋白特异地表达于小胶质细胞。②免疫荧光法和蛋白免疫印迹技术法均证明鞘内注射25mg/Kg利多卡因可明显抑制大鼠L4-5脊髓小胶质细胞上p-p38MAPK表达。
结论：本实验结果揭示，在CCI手术后，大鼠L4-5脊髓的p-p38MAPK蛋白表达明显增加，p-p38MAPK仅特异地表达于脊髓的小胶质细胞上。鞘内注射利多卡因25mg/kg可以明显抑制大鼠CCI神经痛模型所引起的触觉异常疼痛，部分机制可能是由于抑制了L4-5脊髓小胶质细胞p-p38MAPK表达。
第三部分利多卡因抑制ATP诱导的大鼠小胶质细胞分泌TNF-α，IL-1β和IL-6
目的：第二部分研究发现，小胶质细胞内表达的p38MAPK在CCI神经损伤模型导致的神经痛中扮演重要的角色。而鞘内注射利多卡因可抑制小胶质细胞内p38MAPK的激活。本研究应用ELISA，蛋白免疫印迹技术法和RealtimePCR等方法研究利多卡因对ATP诱导的原代培养的小胶质细胞内钙离子，肿瘤坏死因子α(TNF-α)，白介素1β(IL-1β)和白介素6(IL-6)的影响，并了解其和小胶质细胞的p38MAPK信号通路之间的关系。
方法：原代培养大鼠小胶质细胞，随机分为5组：Control组，1mMATP组，1mMATP+0.1mMLidocaine组，1mMATP+1mMLidocaine组，1mMATP+10mMLidocaine组。①用蛋白免疫印迹技术法观察，不同浓度利多卡因对1mMATP诱导的原代培养的小胶质细胞p-p38MAPK的表达情况。②用RealtimePCR的方法，观察不同浓度利多卡因对1mMATP诱导的原代培养的小胶质细胞内TNF-α，IL-1β和IL-6mRNA水平变化情况。③用ELISA方法观察不同浓度利多卡因对1mMATP诱导的原代培养的小胶质细胞内TNF-α，IL-1β和IL-6蛋白水平变化情况。④用单细胞钙成像法观察不同浓度利多卡因对1mMATP诱导的原代培养的小胶质细胞内钙变化的影响。⑤用MTT方法了解不同浓度利多卡因对原代培养的小胶质细胞活力影响。
结果：①蛋白免疫印迹实验结果发现，10mM利多卡因可明显抑制1mMATP诱导的原代培养的小胶质细胞p-p38MAPK的表达(P＜0.05)。②RealtimePCR结果显示利多卡因可明显抑制1mMATP诱导的原代培养的小胶质细胞内TNF-α，IL-1β和IL-6mRNA水平，呈浓度依赖性，10mM利多卡因最为明显(分别为P＜0.01，P＜0.05，P＜0.05)。③ELISA结果发现利多卡因可明显抑制1mMATP诱导的原代培养的小胶质细胞内TNF-α，IL-1β和IL-6蛋白水平表达，呈浓度依赖性，10mM利多卡因最为明显(分别为P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01)。④单细胞钙成像结果显示10mM利多卡因可以明显抑制对1mMATP诱导的原代培养的小胶质细胞内钙增加(P＜0.05)。⑤MTT结果发现本实验浓度的利多卡因对原代培养的小胶质细胞活力无影响.
结论：本实验结果显示，利多卡因可以抑制ATP诱导的大鼠小胶质细胞分泌TNF-α，IL-1β和IL-6，其机制可能是抑制ATP诱导的细胞内钙增加以及小胶质细胞内的p-p38MAPK激活。