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槐耳(Perenniporia robiniophila(Murrill)Ryvarden)是一种富含多种药物活性的食药用真菌,药理研究表明槐耳的主要活性成分是多糖。槐耳多糖可以提高机体的自身免疫力,阻碍肿瘤细胞的生长,促进肿瘤细胞的凋亡,在肝癌、膀胱癌及白血病等疾病的辅助治疗中起明显作用,因此槐耳多糖的市场需求在不断的扩大。但是,槐耳的野生资源相对稀少,人工栽培技术也不够成熟,所以利用分子实验的方法来提升槐耳多糖的产量具有十分重要的意义。 本试验中所利用的是实验室已经获得的参与槐耳多糖合成的关键基因,分别是UDP-葡萄糖脱氢酶基因(UDPGDH)、无机焦磷酸酶基因(IPPA)和1,6-二磷酸果糖激酶基因(FBPase)。其中已经构建了含1,6-二磷酸果糖激酶基因(FBPase)的表达载体,被命名为pCA-fbp。表达载体所用的是香菇启动子gpd,载体上的筛选抗性基因为潮霉素基因(hygB)。 本试验以香菇菌株鲁香1号为研究对象,经改造表达载体pCA-fbp,获得了新的表达载体pCA-ud和pCA-ippa。通过建立农杆菌介导的转化体系,将两个槐耳多糖合成相关基因首先转入香菇,验证其是否在香菇菌株中进行表达,并对得到的转化子进行多糖测定。主要研究成果如下: 1、将UDP-葡萄糖脱氢酶基因和无机焦磷酸酶分别连接到构建好的载体上,以鲁香1号菌丝为侵染材料,以农杆菌转为介导将基因整合到鲁香1号基因组中。本次试验选用的农杆菌菌株为EHA105,侵染过程中所用的表面活性剂是浓度为200μM的乙酰丁香酮(AS),筛选时所用的筛选基因是浓度为10μg/mL潮霉素。经过重重筛选,本试验获得了含目的基因UDPGDH的转化子为2个,含IPPA的转化子为11个。 2、将得到的转化子与亲本做发酵实验,每个转化子做5组平行。种子液发酵5d后以10%的接种量接入新鲜培养基,培养5 d后得到一级发酵液再以10%的接种量接入新鲜培养基,培养6 d后用苯酚-硫酸法测定多糖。测定结果显示,转化子UD(1)、I9、I11、I14、I18和I19的多糖含量较亲本有明显提高。 本试验构建了槐耳产多糖相关基因的表达载体,并通过农杆菌介导将目的基因转入香菇,最终得到多糖含量有所提高的香菇菌株。这不仅为香菇多糖的开发利用做出贡献,也为槐耳多糖高产菌株的选育奠定基础。