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花生是我国主要油料作物,其总产居各油料作物之首,花生品质改良育种对我国的经济发展具有重要意义。传统的育种技术周期长,特定成分提高幅度有限,农艺性状难以综合。基因工程为作物品种遗传改良提供了一个高效的技术手段,可以大大缩短育种周期和提高育种效率。因此,应用基因工程技术对花生脂肪酸组分改良具有重要理论与实践意义。本研究以花生品种E12幼苗为材料提取总RNA,并分离mRNA,利用SMART (Switching Mechanism at5’end of RNA Transcript)技术合成双链cDNA。经限制性内切酶SfiⅠ酶切,将经过分级分离得到的cDNA连接到改造的质粒载体pBluescriptⅡSK,构建了花生幼苗cDNA文库。经检测,所构建丈库的滴度为1.1×106cfu/mL,重组率为93.4%,插入片段大小为750～2000bp。利用高通量测序技术获得大批高质量序列,利用生物信息学方法进行Unigene归并和序列注释分析,得到了4074条Unigenes,其中3897条序列有相关同源信息。从构建的cDNA文库中获得了两个磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,简称PEPC)基因片段(编号为HS096-h02和HS092-d05),通过RACE和RT-PCR方法,获得两个花生PEPC基因序列,分别命名为AhPEPC1(GenBank登录号：EU391629)和AhPEPC2(GenBank登录号：FJ222240)；同时,根据公布的拟南芥PEPC基因家族的4个基因和大豆PEPC基因家族的5个基因,设计简并引物,利用RACE技术结合RT-PCR方法,从花生中分离了另外三个PEPC基因,分别命名为AhPEPC3(GenBank登录号FJ222826), AhPEPC4(GenBank登录号：FJ222827)和AhPEPC5(GenBank登录号FJ222828)。AhPEPC1-5基因开放阅读框长度为2,907bp,2,901bp,2,901bp,2,910bp和3,111bp；分别编码968,966,966,969和1036个氨基酸残基。荧光定量PCR结果显示,花生AhPEPCl、AhPEPC2、AhPEPC3、AhPEPC4和AhPEPC55个基因在普通花生和高油分花生品种的四种不同组织(根、茎、叶和种子)中都有表达,表达模式各不相同。除AhPEPC2外,AhPEPC1、AhPEPC3、 AhPEPC4、AhPEPC5四个基因在普通花生中的表达量均显著高于高油分花生品种。从构建的cDNA文库中还获得了一个花生β-酮脂酰-ACP合成酶Ⅱ(beta-ketoacyl-ACP synthetase Ⅱ,简称KAS Ⅱ)基因和一个硬脂酰-载体蛋白去饱和酶(Stearoyl-ACP desaturase,简称SAD)基因的部分序列(编号为HS137H08),以此为基础,利用RACE方法扩增得到包含这两个基因完整编码区的cDNA序列,分别命名为AhKAS II (GenBank登录号：FJ358425)和AhSAD (GenBank登录号：FJ230310)。获得的AhKAS I序列长度为1867bp,编码404个氨基酸；AhSAD序列长度为1499bp,编码406个氨基酸。采用荧光定量PCR技术对这两个基因在不同花生品种、不同花生组织(根、茎、叶和种子)中的表达分别进行研究,结果表明这两个基因在花生不同组织中的表达差异都十分显著,AhKAS1基因在种子中的表达最为突出,AhSAD在种子和叶中的表达量最高,推测这两个基因可能在植物种子的生长发育过程中起重要的作用,另外不同花生品种间的基因表达量也存在差异。利用生物信息学方法,从普通花生和高油酸花生品种中分别获得了△12脂肪酸脱氢酶基因的全长cDNA序列,分别命名为AhFAD2B和AhFAD2B’。分析两个基因的编码区序列发现,AhFAD2B’基因序列在起始密码子后第442bp处有碱基A的插入,导致编码区提前终止,编码一个截短蛋白AhFAD2B’,丢失了一个膜结合蛋白保守的组氨酸框。表达分析显示,AhFAD2B在高油酸花生品种中的表达量显著低于普通花生品种中的表达量。利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)进行AhFAD2B和AhFAD2B’基因编码蛋白的酶活性验证,发现转AhFAD2B基因的酵母菌株有△12脂肪酸脱氢酶活性,而转AhFAD2B’基因的酵母菌株没有表现出△12脂肪酸脱氢酶活性。推测AhFAD2B’基因序列的变化可能导致了高油酸花生中△12脂肪酸脱氢酶活性的降低或失活。