心肌梗死是冠心病中的急危重症，冠状动脉内粥样斑块通常不稳定极易破溃，从而引起出血，并且形成血栓，进一步管腔闭塞。通常患有心肌梗死的患者血管病变越重，其死亡率越高。糖尿病是导致冠心病的一个独立且重要的危险因素。糖尿病患者患冠心病的风险更高，冠心病合并糖尿病常为多支冠状动脉血管受累，病变弥漫且广泛，冠状动脉内更易形成斑块和血栓。防治冠心病合并糖尿病现已成为全世界医学和社会经济的巨大挑战课题之一。　　目的：　　Notch信号通路参与细胞发育、分化、增殖、凋亡、粘附等过程，与心血管疾病密切相关，其通过提高心肌细胞活力、抑制细胞凋亡、防止心室重构以及抑制心肌纤维化，从而发挥其对心脏的保护作用。在动脉粥样硬化、心肌梗死和心肌肥厚、心力衰竭模型中发现Notch信号通路的活性增强。但是以往研究均在非糖尿病模型中进行，关于Notch信号通路在糖尿病并发症方面的研究，只局限于糖尿病肾病。目前国内外还没有关于Notch信号通路在心肌梗死合并糖尿病动物模型中表达的相关研究报道。因此本实验建立心肌梗死合并糖尿病大鼠模型，检测Notch信号通路中Notch受体(Notch1、Notch4)、配体(Jagged1、Dll1)及Notch共激活子(Mastermind-like protein1、p300)的表达水平，并且进一步通过体外心肌细胞实验应用激动剂激活Notch信号通路从而进一步证明该信号通路具有提高心肌梗死合并糖尿病大鼠心肌细胞活力、抑制心肌细胞凋亡，保护心肌的作用，为临床上心肌梗死合并糖尿病的患者找到新的治疗靶点提供实验理论依据。　　实验方法：　　第一部分:Notch1、Notch4/Jagged1、Dll1/Mastermind-like protein1、p300在心肌梗死合并糖尿病大鼠心肌中的表达水平及其保护作用研究　　本研究采用SD大鼠进行如下在体动物实验:　　1、实验动物模型的建立:选取6-8周龄健康雄性SD大鼠，体重200-250克。　　糖尿病组(DM)、糖尿病假手术组（DM-sham，只进行开胸手术及穿线，但不结扎冠状动脉）、心肌梗死合并糖尿病组(DM-MI)中的糖尿病大鼠为一次性腹腔注射STZ诱导的糖尿病大鼠动物模型（血糖大于396mmol/L作为建模成功）。对照组（Control）和心肌梗死组(MI)不做处理，心肌梗死组(MI)和心肌梗死合并糖尿病组(DM-MI)大鼠通过开胸结扎冠状动脉前降支25分钟，再灌注2小时建立大鼠缺血-再灌注心肌梗死模型。　　2、实验分组:将SD大鼠随机分为以下5组，每组6只。　　(1)对照组(Control):正常SD大鼠　　(2)糖尿病组(DM): SD糖尿病大鼠（购买于上海斯莱克实验动物有限公司）　　(3)糖尿病假手术组(DM-sham): SD糖尿病大鼠+缺血—再灌注假手术　　(4)心肌梗死组(MI): SD大鼠+缺血—再灌注手术　　(5)心肌梗死合并糖尿病组(DM-MI): SD糖尿病大鼠+缺血—再灌注手术　　3、心肌梗死面积的测定:采用TTC染色方法。　　4、各实验组大鼠血清中磷酸肌酸激酶同功酶(CK-MB)和肌钙蛋白的测定:应用ELISA方法。　　5、各实验组大鼠心肌纤维化程度的评价:应用Masson染色方法观察各组大鼠的心脏病理结果。　　6、各实验组大鼠心脏心肌细胞凋亡率的检测:采用原位末端转移酶标记染色法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTPnick end labeling,TUNEL)。　　7、各实验组大鼠心肌中Notch1、Notch4、Jagged1、Dll1、Mastermind-like protein1和p300 mRNA的表达水平的检测:采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法。　　8、各实验组大鼠心肌中Notch1、Notch4、Jagged1、Dll1、Mastermind-like protein1和p300蛋白的表达水平的检测:采用Western blot方法。　　第二部分:激活Notch信号通路对缺氧合并高糖心肌细胞的保护作用及机制研究　　本研究在体外培养的H9C2心肌细胞中进行如下实验:　　1、实验分组:　　(1) H9C2:置于37℃，5％CO2的培养箱内正常培养H9C2心肌细胞;　　(2)缺氧组:置于95％N2、5％CO2的培养箱内培养，培养液正常;　　(3)高糖组:培养液中加入33mmol/L的葡萄糖置于37℃，5％CO2的培养箱内培养72h;　　(4)缺氧+高糖组:培养液中加入33mmol/L的葡萄糖置于95％N2、5％CO2的培养箱内培养;　　(5)缺氧+Jagged-1组:将缺氧H9C2细胞在加入5μg/mL Jagged-1的培养液中培养;　　(6)缺氧+高糖+Jagged-1组:同时进行缺氧及33mmol/L的葡萄糖处理，细胞在加入5μg/mL Jagged-1的培养液中培养。　　2、各实验组心肌细胞活力的检测:采用MTT比色法，观察心肌细胞存活、生长、增殖的情况。　　3、各实验组心肌细胞凋亡的检测:采用流式细胞技术。　　4、各实验组大鼠心肌细胞Notch1、Notch4、Jagged1、Dll1、 Mastermind-likeprotein1和p300 mRNA的表达水平的检测采用实时荧光定量PCR(Real-timePCR)方法。　　5、各实验组大鼠心肌细胞中Notch1、Notch4、Jagged1、Dll1、Mastermind-likeprotein1和p300蛋白的表达水平的检测:采用Western blot方法。　　结果：　　1、建立心肌梗死合并糖尿病大鼠动物模型，TTC染色结果显示:心肌梗死合并糖尿病组大于单纯心肌梗死组心肌坏死面积(p＜0.05)。　　2、各组大鼠心肌组织病理结果显示:Control组大鼠心肌纤维排列比较紧密，心肌细胞结构清晰，DM-MI大鼠心肌纤维的横纹丢失，心肌组织溶解，心肌细胞排列紊乱，出现大量蓝色胶原纤维组织，成纤维细胞增多。　　3、在体实验中各组大鼠心肌细胞凋亡率结果显示:单纯心肌梗死和单纯糖尿病大鼠心肌细胞出现大量凋亡，并且心肌梗死合并糖尿病组大鼠心肌细胞凋亡程度明显加重(p＜0.05)。　　4、各组大鼠血清CK-MB和TNT结果显示:单纯心肌梗死组大鼠和心肌梗死合并糖尿病大鼠血清中CK-MB和肌钙蛋白的水平都明显升高(P＜0.05)。　　5、各组大鼠心肌组织中Notch1、Notch4、Jagged1、Dll1、Mastermind-like protein1和p300在mRNA和蛋白水平的表达，结果显示单纯糖尿病大鼠和单纯心肌梗死大鼠Notch通路表达均升高(P＜0.05)，而心肌梗死合并糖尿病大鼠Notch通路各指标在mRNA和蛋白水平的表达均呈下降的趋势(P＜0.05)。　　6、各组H9C2心肌细胞活力的检测，结果显示:缺氧和高糖对心肌细胞H9C2有一定的损伤作用，缺氧合并高糖同时作用时心肌细胞损伤作用更为严重(P＜0.05)，当给予Notch通路激活剂Jagged-1后，心肌细胞损伤有所减轻(P＜0.05)，细胞活力有所提高。　　7、各组H9C2心肌细胞调亡程度的检测，结果显示:缺氧和高糖促进H9C2细胞凋亡，并且二者共同作用时凋亡细胞明显增多(P＜0.05)。在给予Notch信号通路激活剂Jagged-1后，细胞凋亡总趋势减少(P＜0.05)，但是在早期凋亡和晚期凋亡中有轻微差异。　　8、各组H9C2心肌细胞Notch1、Notch4、Jagged1、Dll1在mRNA和蛋白水平上的表达，结果显示:Notch通路在缺氧和高糖刺激下的H9C2心肌细胞中被激活，而缺氧+高糖同时作用于心肌细胞Notch通路的受体和配体表达明显降低。　　结论：　　1、心肌梗死合并糖尿病大鼠较单纯心肌梗死大鼠心肌坏死面积更大、心肌纤维化程度更重、心肌细胞凋亡程度更加严重。　　2、在单纯糖尿病和单纯心肌梗死大鼠的心肌组织中，Notch受体、配体以及Notch共激活子的表达均呈升高的趋势，而心肌梗死合并糖尿病大鼠的Notch信号通路各指标反而呈降低的趋势。　　3、缺氧和高糖降低H9C2心肌细胞活力，加重细胞凋亡，并且二者共同作用时Notch信号通路的作用相对减弱。　　4、激活Notch信号通路，对缺氧及缺氧合并高糖心肌细胞具有促进细胞增殖，抑制心肌细胞凋亡的心肌保护作用。