研究背景：急性髓性白血病(acute myeloid leukemia, AML)是一种异质性很强的恶性克隆性疾病,严重影响人类的健康。近年来,随着化疗、造血干细胞移植、基因靶向治疗以及生物免疫治疗等多种治疗方法的发展,AML患者的完全缓解率及5年无病生存率均较前有所改善,但是仍有大部分患者出现耐药和复发,预后不良。白血病多药耐药(multidrug resistance, MDR)的产生是导致化疗失败的关键因素,也是造成白血病患者复发、难治的重要原因。白血病多药耐药是指白血病细胞对一种化疗药物产生耐药后,同时对不同化学结构和不同作用机理的多种化疗药物产生交叉耐药的现象,包括原发性耐药与继发性耐药。MDR产生机制非常复杂,包括药物外排介导的耐药、MDR相关酶类异常所致耐药、药物作用靶点基因突变、肿瘤干细胞、细胞凋亡受抑、周期阻滞、药代动力学的改变等。因此从多个角度阐明AML多药耐药的机制,寻找有效逆转多药耐药的方法,不仅是克服AML多药耐药的重要思路,也是准确评估预后、改善患者生存率的必由之路。MicroRNA (miRNAs)是一类长度为19-25nt,序列高度保守的内源性非编码小RNA分子。成熟miRNA通过与目的基因3’端非编码(3’-UTR)区结合促使靶基因抑制或蛋白降解,在转录或转录后水平调控基因表达,广泛参与细胞的增殖、凋亡、分化、免疫系统、个体发育以及机体代谢等一系列生命过程。近年来研究发现,白血病中miRNA表达谱存在差异表达,在白血病形成及疾病进展过程中,miRNA参与癌细胞生物程序的调控,表现出癌基因或抑癌基因的作用。但是,关于miRNA在AML耐药过程中的作用机制尚不十分明确,有待于进一步研究。因此,筛选在AML耐药中起关键作用的miRNA并阐明其具体作用机制,研究急性髓性白血病中miRNA的异常表达与临床化疗敏感性、预后的关系,可以为难治/复发AML的早期预警和检测提供新的生物学标记物,对于提高难治/复发AML诊疗水平具有重要的临床意义。研究目的：筛选并鉴定出参与AML多药耐药的miRNA分子；研究该miRNA分子在成人AML骨髓标本中的表达,分析其与临床特征的关系；明确该miRNA分子在AML多药耐药中的作用；进一步确定该miRNA分子的靶基因,并探讨其参与AML多药耐药的机制,从而为逆转AML耐药带来全新的治疗思路和方案。研究方法：1.应用miRNA芯片技术筛选AML敏感与耐药细胞株之间差异表达的miRNA分子,选取差异倍数较高的miRNA分子作为候选分子。2.标本采集：收集120例AML患者和40例健康对照者的骨髓标本,其中AML患者标本分为初诊组(56例),完全缓解组(44例)以及复发／难治组(20例)。采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离收集标本中骨髓单个核细胞,-80℃保存备用。3.实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(Real-time RT-PCR)法检测miR-29b的表达情况：采用mirVanaTM miRNA Isolation试剂盒提取AML患者骨髓单个核细胞及AML细胞株中miRNA,应用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription (RT)试剂盒将miRNA逆转录为cDNA,应用TaqMan探针Real-time RT-PCR方法检测AML患者骨髓单个核细胞及AML细胞株miR-29b表达水平,验证芯片结果。4. miR-29b, AFlq和CD44分子在AML耐药中的作用。4.1细胞转染：应用Lipofectamine2000分别将miR-29b模拟物(mimic)或抑制剂(inhibitor)及各自阴性对照转染AML敏感与耐药细胞株,48小时后收集各组细胞,Real time RT-PCR检测转染后miR-29b表达情况。4.2病毒包装及细胞感染：分别包装携带AF1q表达载体或AF1q shRNA的慢病毒,感染AML敏感或耐药细胞株,上调或下调AF1q表达,48小时后荧光显微镜观测感染效率,应用Blastin药物筛选获得稳定感染细胞,Real timeRT-PCR、Western blot方法检测病毒感染稳筛后AF1q表达情况。4.3载体构建：构建携带CD44shRNA的真核表达载体,转染AML耐药细胞株,Real time RT-PCR和Western blot实验方法检测转染后CD44表达情况。4.4CCK8法检测药物敏感性：将稀释成一定浓度梯度的化疗药物阿霉素(DOX),阿糖胞苷(Ara-C),去甲氧柔红霉素(IDA)分别加入改变miR-29b, AF1q和CD44分子表达后的各组细胞,孵育48小时,CCK8法检测AML敏感及耐药株细胞对化疗药物的敏感性,分别计算各组细胞对三种化疗药物的IC50值。4.5流式细胞术检测细胞凋亡：选取一定浓度的阿霉素(DOX),阿糖胞苷(Ara-C),去甲氧柔红霉素(IDA)分别加入改变miR-29b, AF1q和CD44分子表达后各组细胞,作用48小时后,经AnnexinV/PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡率。5. MiR-29b/AF1q/CD44作用轴调控机制研究。5.1生物信息学方法预测miR-29b分子可能调控的下游靶基因AF1q, Real-time RT-PCR、Western blot实验检测miR-29b分子表达变化对靶基因AF1q表达水平影响。5.2双荧光素酶报告实验验证miR-29b与下游靶基因AF1q结合作用：构建AF1q基因3’-UTR区野生及突变型荧光素酶报告载体,检测miR-29b上调后荧光素酶活性的改变。5.3Real-time RT-PCR、Western blot实验检测AF1q、CD44在AML细胞株及上述收集AML骨髓标本中mRNA及蛋白水平的表达情况,统计分析miR-29b和AF1q、CD44表达相关性。5.4AF1q对下游基因CD44表达水平影响：收集稳定筛选后AFlq上调或下调AML细胞株,Real-time RT-PCR, Western blot实验检测AF1q分子表达变化对下游基因CD44在mRNA及蛋白表达水平影响。5.5MiR-29b对下游基因CD44表达水平影响：应用Lipofectamine2000分别将miR-29b mimic或miR-29b inhibitor及各自阴性对照转染AML细胞株,48小时后收集各组细胞,Real-time RT-PCR, Western blot实验检测miR-29b分子表达变化对下游基因CD44在mRNA及蛋白表达水平影响。5.6将DOX作用与AML细胞并分别于12h,24h,48h收集细胞,设不加药对照组。利用Real-time RT-PCR和Western blot方法检测AFlq和CD44表达。5.7细胞分组：①miR-29b mimic转染组；②miR-NC转染组；③AF1q表达载体转染组；④AF1q表达载体对照转染组；⑤miR-29b mimic+AF1q表达载体同时转染组；⑥miR-29b mimic+AF1q表达载体对照同时转染组；⑦miR-NC+AF1q表达载体对照同时转染组。CCK8法检测上述各组细胞药物敏感性,Western blot实验检测CD44表达水平。5.8双荧光素酶报告实验检测AFlq对CD44的转录调控作用：构建含有CD44启动子区域的荧光素酶报告载体,上调AFlq表达检测荧光素酶活性变化。5.9免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, Co-IP)实验检测AFlq蛋白与TCF7L2结合作用：构建携带有6myc标签AFlq基因全长表达载体,同时构建带有FLAG标签的TCF7L2表达载体,应用Lipofectamine2000共转染HEK293细胞,Co-IP实验检测验证AFlq蛋白与TCF7L2结合作用。5.10蛋白染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation, CHIP)实验检测TCF7L2与CD44分子启动子区域结合作用：通过生物信息学软件预测TCF7L2与CD44分子启动子区域具体结合位点,设计CD44引物序列,将TCF7L2分子表达载体转染HEK293细胞,CHIP实验检测TCF7L2与CD44分子启动子区域结合作用。6.统计分析：应用SPSS17.0软件处理数据,采用t检验和Mann-Whitney U秩和检验对数据分别进行差异性分析,P<0.05为差异有统计学意义。研究结果：1.芯片结果：应用miRNA芯片技术在K562与耐药株K562/A02、HL60与耐药株HL60/ADM间筛选出24种表达明显差异的miRNA分子,选择表达明显差异的miR-29b、miR-181b作为候选miRNA分子。2.验证芯片结果：Real time RT-PCR结果表明与AML敏感株K562、HL60相比较,miR-29b在耐药株K562/A02、 HL60/ADM中表达明显下调。3. miR-29b, AF1q和CD44分子在AML患者骨髓标本中的表达水平：3.1miR-29b在AML初诊组和难治／复发患者组中表达明显低于健康对照组；初诊AML患者miR-29b表达水平明显高于难治／复发组患者；完全缓解组AML患者miR-29b表达水平明显高于初诊组和难治／复发组患者；而健康对照组与完全缓解组相比较miR-29b表达水平无明显差异。3.2与健康对照组相比较,AFlq在AML初诊组和难治/复发患者组中表达明显上调；初诊组和难治/复发组AML患者AF1q表达水平明显高于完全缓解组患者；初诊AML患者AFlq表达水平明显低于难治/复发组患者；健康对照组与完全缓解组相比较AFlq表达水平无明显差异。3.3CD44分子在AML初诊组和难治/复发患者中表达明显高于健康对照组；初诊组和难治/复发组AML患者CD44表达水平较完全缓解组AML患者明显升高；初诊AML患者CD44表达水平较难治/复发组AML患者显著降低；完全缓解组与健康对照组与相比较CD44表达水平无明显差异。4. miR-29b, AF1q和CD44分子在AML多药耐药中的作用：4.1Real time RT-PCR结果证实miR-29b mimic可明显上调miR-29b在AML耐药细胞株中的表达水平,miR-29b inhibitor可显著下调miR-29b在AML敏感细胞株中的表达水平。4.2Real time RT-PCR、Western blot结果显示携带AFlq表达载体的慢病毒可有效上调AF1q表达,携带AF1q shRNA的慢病毒可有效下调AFlq表达。4.3将CD44shRNA真核表达载体转染AML耐药细胞后,Real time RT-PCR、 Western blot结果显示CD44表达水平较对照组明显下调。4.4miR-29b,AF1q和CD44分子表达变化对AML细胞药物敏感性的影响：CCK8检测发现,miR-29b表达上调,AFlq或CD44表达下调均明显增加了AML耐药细胞株(K562/A02、HL60/ADM)对化疗药物的敏感性；抑制miR-29b表达或上调AFlq表达明显降低了AML敏感细胞株(K562、HL60)对化疗药物的敏感性。4.5miR-29b, AF1q和CD44分子表达变化后对化疗药物诱导AML细胞凋亡的影响：AnnexinV/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率显示,miR-29b表达上调,AFlq或CD44表达下调后,化疗药物诱导的AML耐药细胞株(K562/A02、 HL60/ADM)凋亡率明显升高；抑制miR-29b表达或上调AFlq表达后,化疗药物诱导的AML敏感细胞株(K562、HL60)凋亡率明显下降。5. MiR-29b/AF1q/CD44作用轴调控机制研究：5.1采用生物信息学软件(target scan和pictar)预测AFlq为miR-29b下游靶基因。在AML耐药细胞株中有效上调miR-29b表达水平后,AF1q蛋白表达水平均明显降低; miR-29b表达水平明显下调后,AFlq蛋白表达水平明显升高。5.2双荧光素酶报告实验证实miR-29b直接结合与AF1q3’-UTR区的预测靶位点。5.3Real time RT-PCR、Western blot结果显示AFlq和CD44分子在AML耐药株K562/A02. HL60/ADM中表达水平显著高于AML敏感株K562、HL60。Spearman秩相关分析结果显示：miR-29b和AF1q的表达水平呈显著负相关关系；miR-29b和CD44的表达水平呈显著负相关；AF1q和CD44的表达水平呈显著正相关关系。5.4Real time RT-PCR、Western blot结果显示AFlq表达上调后,CD44分子表达明显上调；AFlq表达下调后,CD44分子表达亦明显下调。5.5Real time RT-PCR、Western blot结果显示,在AML耐药株中过表达miR-29b可明显下调CD44分子在mRNA和蛋白水平表达；抑制miR-29b表达可显著上调CD44分子在mRNA和蛋白水平表达。5.6CCK8. Western blot实验结果显示：AFlq表达上调可减弱miR-29b的逆转耐药作用以及对CD44的正调控作用。5.7Real time RT-PCR、Western blot结果显示：化疗药物作用于AML耐药细胞后,AF1q和CD44表达水平显著降低；并且随着时间延长,AF1q和CD44表达均逐渐下调,呈正相关关系。5.8双荧光素酶报告实验结果显示AFlq结合于CD44启动子区域,在转录水平调控CD44表达活性。5.9Co-IP实验证实AFlq蛋白与TCF7L2存在结合作用。5.10CHIP实验证实TCF7L2作用于CD44分子启动子区域。结论：1. MiRNA分子在AML敏感细胞株及耐药细胞株之间表达谱存在明显差异,提示miRNA分子可能参与AML耐药过程。2.逆转miR-29b在AML耐药细胞株中的表达水平后,明显增加了AML耐药细胞对化疗药物的敏感性和化疗药物诱导的细胞凋亡。3. MiR-29b, AF1q和CD44分子形成miR-29b/AF1q/CD44作用轴在AML耐药发生、发展过程中发挥重要作用,有望成为AML治疗的新靶点。4.AFlq通过与Wnt/β-catenin信号通路TCF7L2转录因子共同作用,在转录水平激活CD44表达。MiR-181b在急性髓性白血病多药耐药中的作用及机制研究研究目的：检测niR-181b在AML细胞株中的表达水平,验证芯片结果；检测miR-181b在成人AML骨髓标本及健康对照组中的表达,分析其与临床特征的关系；明确miR-181b在AML耐药中的作用；预测并验证miR-181b的靶基因,进一步探讨miR-181b参与AML耐药发生发展的分子机制,为白血病治疗提供新的靶点。研究方法：1.标本采集：收集AML病患共80例,健康对照20例。AML患者骨髓标本包括初诊组(31例),完全缓解组(37例)和复发/难治组(12例)。采用淋巴细胞分离液(Ficoll)密度梯度离心法分离骨髓标本中单个核细胞,-80℃保存备用。2. Taqman探针Real-time RT-PCR法检测miR-181b的表达情况：mirVanaTM miRNA Isolation试剂盒提取AML细胞株miRNA, MicroRNA Reverse Transcription (RT)试剂盒逆转录获得cDNA, Taqman探针Real-time RT-PCR方法检测AML敏感及耐药细胞株miR-181b表达水平,验证芯片结果。3. miR-181b在AML骨髓标本中表达情况检测：Taqman探针Real-time RT-PCR法检测AML患者及健康对照骨髓单个核细胞中miR-181b表达水平,分析miR-181b表达与临床疗效、病程及预后的相关性。4. miR-181b在AML耐药中的生物学作用研究。4.1细胞转染：分别将miR-181b mimic及其阴性对照miR-NC, miR-181b inhibitor及其阴性对照miR-inNC转染AML耐药细胞株K562/A02与HL60/ADM,48小时后收集细胞,应用Real time RT-PCR方法检测转染后miR-181b表达情况。4.2CCK8法检测药物敏感性：将不同浓度梯度的DOX、Ara-C和IDA分别加入转染后的各组细胞,孵育48小时,CCK8法检测AML耐药细胞株对化疗药物敏感性并计算各组细胞对三种化疗药物的IC50值。4.3流式细胞术检测细胞凋亡：选取一定浓度的DOX、Ara-C和IDA分别作用与转染后各组细胞,作用48小时后,经AnnexinV/PI染色,流式细胞仪检测细胞凋亡率。5.确定miR-181b分子的靶基因,进一步探讨其参与AML耐药的机制。5.1生物信息学方法预测miR-181b分子可能调控的下游靶基因。5.2Real-time RT-PCR、Western blot实验检测miR-181b分子表达上调或是下调后下游靶基因HMGB1和Mcl-1表达水平。5.3双荧光素酶报告实验验证miR-181b与下游靶基因结合作用：分别构建HMGB1和Mcl-1基因3’-UTR区野生及突变型荧光素酶报告基因载体,转染HEK293细胞检测miR-181b上调后对荧光素酶活性的影响。6. HMGB1在AML耐药中的生物学作用研究。6.1Real-time RT-PCR、Western blot实验检测HMGB1在AML细胞株及上述收集AML患者及健康对照标本中mRNA及蛋白的表达情况,分析HMGB1与临床疗效、病程及预后的相关性。6.2设计合成HMGB1siRNA,转染AML耐药细胞株,48小时后收集细胞,应用Real time RT-PCR和Western blot检测转染后HMGB1表达情况。6.3CCK8实验检测转染后AML细胞药物敏感性：将DOX、Ara-C和IDA三种化疗药物与各组细胞共孵育48小时后,CCK8法检测AML耐药细胞株对化疗药物敏感性的变化并比较各组细胞对三种化疗药物的IC50值。6.4流式细胞术检测转染后AML细胞凋亡：将DOX、Ara-C和IDA三种化疗药物作用于各组细胞48小时后, AnnexinV/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率。7.统计分析：应用SPSS17.0软件处理数据,采用t检验和Mann-Whitney U秩和检验对数据进行统计分析,P<0.05为差异有统计学意义。研究结果：1.验证芯片结果：miR-181b在AML耐药株K562/A02、HL60/ADM中表达较AML敏感株K562、HL60明显下降。2. miR-181b在AML患者骨髓标本中的表达水平：Real time RT-PCR结果显示miR-181b在AML初诊组和难治／复发患者组中表达明显低于健康对照组；初诊AML患者miR-181b表达水平较难治／复发组AML患者明显升高；完全缓解组AML患者miR-181b表达水平较初诊组和难治／复发组AML患者显著上调；健康对照组与完全缓解组相比较miR-181b表达水平无明显差异。3. miR-181b分子在AML多药耐药中的作用：3.1Real time RT-PCR结果显示：miR-181b mimic转染组AML细胞niR-181b表达水平较转染miR-NC组明显升高；miR-181b inhibitor转染组AML细胞miR-181b表达水平较转染miR-181binNC组明显降低。3.2miR-181b表达变化后对AML细胞药物敏感性的影响：miR-181b表达上调后,CCK8实验结果显示AML耐药细胞株(K562/A02、HL60/ADM)对化疗药物的敏感性显著增强。3.3miR-181b表达变化后对化疗药物诱导的AML细胞凋亡影响：miR-181b表达上调后,AnnexinV/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率结果显示化疗药物诱导的AML耐药细胞株(K562/A02、HL60/ADM)凋亡率明显升高。4.确定miR-181b的靶基因,进一步探讨其参与AML耐药的分子机制。4.1采用生物信息学软件(target scan和pictar)预测HMGB1和Mcl-1为miR-181b下游靶基因。4.2在AML耐药细胞株中过表达miR-181b可在转录后水平抑制HMGB1和Mcl-1表达。4.3双荧光素酶报告实验证实miR-181b直接结合于HMGB1和Mcl-13’-UTR区预测靶位点。5. HMGB1分子在AML耐药中的作用：5.1Real-time RT-PCR、Western blot实验结果显示：HMGB1在AML耐药株K562/A02、HL60/ADM中表达水平明显高于AML敏感株K562、HL60。5.2Real-time RT-PCR、Western blot实验结果显示：HMGB1在AML初诊组和难治／复发患者组中表达明显高于健康对照组；初诊组和难治／复发组AML患者HMGB1表达水平较完全缓解组AML患者明显升高；初诊AML患者HMGB1表达水平低于难治／复发组AML患者；完全缓解组与健康对照组相比较HMGB1表达水平无明显差异。5.3Real-time RT-PCR、Western blot结果显示：设计合成的HMGB1siRNA转染AML耐药细胞株48小时后可有效下调HMGB1表达。5.4CCK8实验结果显示：HMGB1表达下调明显增加了AML耐药细胞株(K562/A02. HL60/ADM)对化疗药物的敏感性。5.5AnnexinV/PI染色流式细胞术检测细胞凋亡率显示：HMGB1表达下调后,化疗药物诱导的AML耐药细胞株(K562/A02、HL60/ADM)凋亡率显著升高。结论：1. miR-181b在AML耐药株和难治/复发病患骨髓标本中表达明显下调,提示miR-181b可能在AML耐药过程中有潜在抑癌基因作用。2.在AML耐药细胞株过表达miR-181b可明显增加AML耐药细胞对化疗药物的敏感性和化疗药物诱导的细胞凋亡。3. HMGB1和Mcl-1表达下调为miR-181b发挥逆转耐药作用的可能机制之一。