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第一部分非对称小干扰RNA对USP22基因的沉默效率和特异性的影响目的：探讨非对称小干扰RNA (asymmetric structure interfering RNA, aiRNA)对泛素特异肽酶22(ubiqutin specific peptidase22, USP22)基因的沉默效率和干扰特异性的影响。方法：通过在线生物学软件设计针对USP22基因的三条特异性小干扰RNA (USP22siRNAs)的靶序列和一条非特异性的阴性对照siRNA (control siRNA)。以沉默效率最高的一条USP22siRNA的靶序列为基础设计并合成三条长短不同的非对称小干扰RNA(USP22aiRNAs)。利用脂质体Translipid转染膀胱癌EJ细胞,通过实时荧光定量RT-PCR和Western印迹法分别检测转染USP22siRNA和USP22aiRNA前后膀胱癌EJ细胞的USP22mRNA转录本和蛋白表达水平变化,并比较两者对USP22基因沉默效率和靶向特异性的影响。结果：USP22aiRNA(15/21)能显著抑制膀胱癌EJ细胞的USP22mRNA转录本和蛋白的表达水平,且呈现时间-剂量依赖方式,与传统的USP22siRNA相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。而且USP22aiRNA(15/21)对USP22基因的沉默效率及靶向特异性明显优于传统的USP22siRNA。结论：基于USP22基因的特异性非对称小干扰RNA能够有效下调膀胱癌EJ细胞USP22基因的表达,并降低了传统siRNA所致的非特异“脱靶效应”,同时也减少了受RNA干扰中的浓度“饱和机制”和“竞争机制”的影响,其沉默效率和靶向特异性明显优于传统siRNA。第二部分非对称小干扰RNA特异性沉默USP22基因对膀胱癌EJ细胞增殖和凋亡的影响目的：研究非对称小干扰RNA (asymmetric structure interfering RNA, aiRNA)特异性沉默USP22基因对膀胱癌EJ细胞增殖和凋亡的影响,方法：用脂质体Translipid将USP22siRNA和USP22aiRNA(15/21)转染膀胱癌EJ细胞,通过MTT, EdU和平板克隆形成实验检测转染后EJ细胞的细胞活性。FCM法分析EJ细胞的凋亡和周期分布。结果：与USP22siRNA相比,USP22aiRNA(15/21)组能更有效地抑制膀胱癌EJ细胞的增殖,且细胞周期被阻滞于G1期。然而,与对照组相比,转染USP22siRNA和USP22aiRNA(15/21)对膀胱癌EJ细胞的凋亡均无明显影响。结论：USP22aiRNA(15/21)能够特异性沉默USP22基因的表达,显著抑制膀胱癌EJ细胞的增殖。推测应用基于RNAi技术的USP22aiRNA可能成为治疗膀胱癌的一个新的方法。第三部分USP22基因介导的Mdm2-p53信号通路在膀胱癌EJ细胞增殖中的作用目的：探讨Mdm2-p53通路在USP22基因介导的抑制膀胱癌EJ细胞中的作用。方法：EJ细胞转染USP22aiRNA(15/21)和USP22siRNA后,通过qRT-PCR和Western blot分别检测p53,p21,cycin E基因的mRNA转录本和蛋白水平的表达变化；共同转染p53siRNA和USP22siRNA/USP22aiRNA(15/21)后,通过FCM法检测EJ细胞周期分布,MTT法检测细胞生长活性；转染pcDNA-Mdm2后,通过qRT-PCR和Western blot分别检测EJ细胞USP22和p53基因蛋白表达水平的变化。结果：沉默USP22基因的表达后,膀胱癌EJ细胞中p53基因和p21基因的mRNA转录本和蛋白的表达水平上调,cyclin E的表达水平下调,与对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。当转染p53siRNA后,沉默USP22基因对膀胱癌EJ细胞的生长活性与细胞周期分布无明显影响,与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。然而,当转染pcDNA-Mdm2后,阻滞了USP22siRNA和USP22aiRNA(15/21)对p53表达水平的上调作用。结论：Mdm2-p53信号通路在USP22基因调控膀胱癌EJ细胞的增殖和细胞周期分布中起着关键性的作用。USP22-Mdm2-p53信号通路可能为膀胱癌的基因治疗提供一个新的思路。第四部分藤黄酸抑制TNF-α诱导的前列腺癌PC3细胞迁移和侵袭的机制研究目的：探讨藤黄酸(Gambogic acid, GA)抑制TNF-α诱导的前列腺癌PC3细胞侵袭的潜在机制。方法：不同浓度的GA作用于PC3细胞24h后,MTT法检测细胞的生长活性。迁移及侵袭实验检测GA对TNF-α诱导前列腺癌PC3细胞迁移和侵袭的抑制作用。Western blot检测磷酸化Akt和GSK-3β的蛋白表达水平。荧光素酶报告基因和细胞免疫荧光分别检测NF-kB的转录活性和核转移。染色质免疫共沉淀检测p65基因的启动子结合活性。qRT-PCR和Western blot分别检测转染Snail siRNA后,Snail及其下游靶基因mRNA转录本和蛋白的表达水平。结果：浓度为0.5μmol/L的GA显著抑制TNF-α诱导的前列腺癌PC3细胞的侵袭和转移。同时,GA不仅抑制了TNF-α介导的磷酸化Akt和GSK-3β的激活,而且阻滞了TNF-α诱导的NF-kB的转录活性和核转移。GA的抗肿瘤侵袭作用与调控Snail的表达有关。GA处理后的PC3细胞,Snail的mRNA和蛋白表达水平显著下调。结论：GA通过PI3K/Akt及NF-kB信号通路抑制TNF-α诱导的前列腺癌PC3细胞的迁移和侵袭。