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为了实现外源基因在动物乳腺中的特异高效表达，本研究以牛β-乳球蛋白基因（β-lactogbulin BLG）5’和 3’端调控成分序列， Kana/neo（卡那霉素/新霉素）抗性基因和报告基因 EGFP（增强型绿色荧光蛋白报告基因）为元件，构建了乳腺特异性通用表达载体 pEBF12。pEBF12 载体的 5’和 3’调控区之间，存在数个多克隆酶切位点，便于各种不同外源目的基因插入。通过抗性基因 Kana/neo 和报告基因 EGFP 可进行阳性克隆的筛选，从而构建成为理想的转基因结构，为乳腺生物反应器的研制提供诸多方便，研究结果如下： 1.利用 PCR 方法扩增了牛 BLG 基因 5’端调控成分 BF1 片段（3 572 bp）和 3’端调控成分 BF2 片段（1 003 bp），其中 5’端调控成分 BF1 片段包括 5’侧翼序列，外显子 I、内含子 I 和外显子 II。BF1 片段和 BF2 片段 PCR 产物经回收纯化后，通过 T-A 克隆的方法分别克隆至 pMD18-T Vector 上。pBF1 和 pBF2 重组质粒分别进行 BamH I 酶切鉴定，证明 BF1 和 BF2 片段克隆成功。序列同源性分析表明，BF1 片段与牛 BLG A 型基因、牛 BLGB 型基因、绵羊和山羊 BLG 基因的同源性分别为 96.55%、99.79%、92.70%和 92.09%，BF2片段与上述四种基因的同源性分别为 97.45%、99.83%、93.70%和 92.59%。序列分析表明，牛 BLG 基因 5’调控成分含有诸多调节因子结合位点或反应元件，包括核因子 I（NFZ）结合位点，视黄酸反应元件（RARE），乳腺特异性因子（MSBF），佛波酯反应元件（TRE），乳腺因子（MGF）结合位点，乳汁蛋白结合因子（MFBF）和糖皮质激素效应元件（GRE）等。这些资料提示 BLG 5’端和 3’端调控成分可调控外源基因在乳腺中的特异高效表达，故可用于乳腺生物反应器特异性表达载体的构建。 2. 通过限制性酶酶切连接，将 BF1 片段和 BF2 片段组装于 pMD18-T Vector 中，得到初级通用表达载体（基础性通用表达载体）pBF12。pBF12 以 AseI 酶切鉴定，结果证明 pBF12 基础性通用表达载体构建成功。将含有抗性基因 Kan/neo 和报告基因 EGFP的 pEGFP-C1 质粒用 AseI 消化后，把从基础性通用表达载体 pBF12 上卸下的 BF12 片段插入其中。构建得到乳腺生物反应器通用表达载体 pEBF12。pEBF12 以 AseI 进行酶切鉴定，证明乳腺生物反应器通过表达载体 pEBF12 构建成功。 使用本研究构建的通用乳腺表达载体，可以方便的将各种不同外源基因克隆至此载体中，使之置于乳腺特异表达调控序列控制下，从而构建成各种不同外源目的基因的乳腺特异性表达载体。本试验所构建的这种乳腺生物反应器通用表达载体具有重要的研究和应用价值。