目的与背景卵巢癌病死率居女性生殖器三大恶性肿瘤首位，在确诊时75%的患者已是FIGOIII期以上病变。发生远处转移、侵润和化疗耐药性是卵巢癌高病死率、预后差的关键因素。因此，临床上迫切需要探索卵巢癌治疗及其转移、复发干预治疗的新方法。近年来，靶向药物输送系统治疗卵巢癌备受关注，但始终没有找到高特异性、高亲和力的载体。噬菌体展示技术通过确定表达在不同肿瘤细胞或组织器官上特异性分子的结合肽，并以此结合肽为载体与药物靶向相联，可以有效地提高定向传递化疗药物的能力。目前国内尚未见卵巢癌特异性结合肽的研究报道。因此，本实验拟使用噬菌体展示文库技术首次筛选卵巢癌细胞特异性结合肽，并通过体内外实验研究其对卵巢癌侵袭和转移生物行为的影响，为卵巢癌的靶向治疗提供理想的载体。方法1.利用改良的细胞培养方法分离培养正常卵巢上皮细胞，创新性地运用细胞刷刷取人卵巢表面上皮（human ovarian surface epithelium，HOSE），红细胞裂解法、差速贴壁法对细胞进行分离纯化，并向无血清DMEM-F12培养基中添加人表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）进行细胞培养。在倒置显微镜下观察细胞形态，HE染色和免疫细胞化学染色法对细胞进行鉴定，为后续的筛选试验提供理想的体外试验材料。2.以人卵巢癌细胞HO8910为靶细胞，分离获取的人正常卵巢上皮细胞为吸附细胞，对噬菌体随机环七肽库进行四轮差减筛选；细胞酶联免疫吸附法（ELISA法）验证阳性噬菌体克隆；对获得的阳性克隆进行DNA测序及生物信息学分析,并进一步利用免疫荧光实验,鉴定噬菌体阳性克隆（phage1）与HO8910细胞的特异性结合，为针对人卵巢癌不同位点的靶向药物设计提供实验依据。3.鉴定获取的噬菌体阳性克隆序列后，合成该特异性短肽序列（命名为peptide1），设立卵巢癌HO8910-k1组（peptide1组）、HO8910-k15组（control组）及HO8910组（blank组），通过细胞生长曲线、Transwell体外迁移和重组基底膜侵袭实验、粘附实验研究特异性短肽对HO8910细胞株侵袭和转移能力，探讨特异性合成短肽（peptide1）对卵巢癌体外恶性生物学行为的影响。4.建立特异性短肽结合HO8910细胞裸鼠腹腔移植瘤模型，计算抑瘤率，免疫组化计算血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)的表达和原位凋亡TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡指数（apoptotic index，AI），进一步探讨特异性合成短肽K1（peptide1）对卵巢癌体内恶性生物学行为的影响。结果1.卵巢表面上皮培养24小时开始贴壁生长，7~12天后基本达到融合，细胞呈多角形或扁平型，透光性及折光性强。细胞形态符合正常上皮细胞特性，所分离的细胞几乎完全表达上皮细胞表面标志物CK19。细胞生长良好，可以传6~8代，细胞生长曲线呈“S”形，纯度达95%以上。细胞刷取培养法操作简单，能够快速分离获得大量卵巢表面上皮，所获得的细胞经红细胞裂解法和差速贴壁法处理后纯的达到95%以上，且细胞生长稳定，为组织工程研究提供了充足的种子细胞。2.经过四轮筛选后，噬菌体在靶细胞HO8910上出现了明显的富集现象，第4轮筛选后与第1轮相比,富集了244倍；ELISA对20个随即挑选的克隆进行鉴定，12个可与HO8910特异性结合；DNA测序后得到一段与卵巢癌细胞特异性结合的七肽SWQIGGN（命名为K1），免疫荧光检测显示表达SWQIGGN序列的噬菌体克隆（phage1）能够与HO8910细胞结合，细胞呈绿色荧光反应，并不与人正常卵巢上皮细胞结合，提示phage1能与HO8910细胞特异结合。3.合成并纯化后的的K1，细胞生长曲线显示K1组HO8910细胞自第三天开始生长速度明显慢于其它两组，P＜0.05，差异具有统计学意义。粘附实验和细胞体外迁移侵袭实验表明合成的特异性短肽K1（SWQIGGN）能明显抑制HO8910PM的侵袭和转移能力，与对照组相比P＜0.05，差异具有统计学意义。表明特异性短肽K1（SWQIGGN）能够在体外抑制卵巢癌HO8910细胞的生长、侵袭及转移。4.肿瘤侵袭转移体内实验表明特异性短肽K1（SWQIGGN）组裸鼠生长速度明显受到抑制、肿瘤体积、质量及播散数目均减少，与对照组及空白组相比，差异具有统计学意义（P＜0.5），而对照组与空白组相比，差异无统计学意义（P＞0.5）。表明SWQIGGN肽能够抑制HO8910细胞的增长，并能够在体内抑制卵巢癌HO8910细胞的恶性生物学行为。结论1.运用细胞刷取法成功培养出人卵巢表面上皮，该方法不仅简便，而且高效实用，为卵巢癌的基础和临床研究提供了理想的试验材料。2.采用BRASIL噬菌体展示技术和全细胞差减筛选策略，筛选出卵巢癌表面分子特异性的结合短肽SWQIGGN，为卵巢癌的靶向治疗提供了可能的作用靶向结合位点。3.SWQIGGN短肽能够促进卵巢癌细胞的体内外生长、侵袭及转移能力。4.SWQIGGN肽促进卵巢癌细胞侵袭和转移的机制可能与下调肿瘤内VEGF的表达有关，为进一步选择转移复发预测指标、肿瘤靶向治疗提供了重大线索。