狂犬病是一种由狂犬病病毒引起的人畜共患疾病,该病在全球分布很广,每年死于狂犬病的人数超过5.5万人,其中约95％发生在亚洲和非洲。大多数死亡事件均是被狂犬病毒感染的狗咬伤所致,受害者中30％～60％为15岁以下儿童。狂犬病的预防和治疗通常采用狂犬病疫苗,对于严重感染者还须使用人源或马源免疫球蛋白进行治疗。目前通过美国FDA认证的狂犬病疫苗为神经组织疫苗和Vero细胞培养疫苗,其中Vero细胞培养疫苗应用最为广泛,但因其制备成本高,注射方式和保存方法要求严格等因素,一些落后、贫穷的国家仍采用有严重副反应的神经组织疫苗,而Vero细胞培养疫苗也只是用于发达国家和部分发展中国家。　　 新一代狂犬病疫苗主要从以下几方面进行研究:(1)以腺病毒载体为基础的重组病毒疫苗。这类疫苗虽能刺激新生小鼠产生强烈的初次免疫应答,但对成年动物免疫效果还不明确,并且病毒载体还有整合至宿主染色体的潜在危险。(2)DNA疫苗。这类疫苗可刺激机体产生中和性抗体、CD4+细胞免疫和CD8+细胞免疫反应,但注射要求高,免疫效率低,有一定的应用局限。(3)减毒疫苗。这类疫苗可快速并大量复制狂犬病病毒糖蛋白,免疫效果好且为单剂量注射,但抗体产生具有迟滞性特点,不能及时进行暴露后治疗,而且病毒中致病性成份还需通过分子手段进一步去除,以降低潜在的致病危险。(4)抗体疫苗。这类疫苗采用鸡尾酒疗法效果良好,有望替代人源或马源免疫球蛋白。但因狂犬病毒株有地域差异特点,导致病毒株糖蛋白基因型多样化,通过单一毒株制备的单克隆抗体不具有良好的适应性。　　 消化道给药治疗是通过口服含有治疗性的外源物质,利用消化道吸收功能,使外源物质达到特定部位,纠正出错基因或表达分泌出治疗性蛋白,发挥治疗性作用,从而达到治疗或预防疾病的目的。重组微生物体是目前研究较多的口服药物运送载体之一,它通过消化道给药可以以低剂量的方式达到与普通胃肠道药物载体给药相似的治疗效果。重组微生物在消化道内释放生物活性物质主要通过三种方式,一通过细胞自溶释放胞内物质；二活性物质锚定于细胞壁:三活性物质自细胞分泌到消化腔内。为进行这一研究,本课题选择的微生物载体为酿酒酵母。重组酵母进入消化道后如果存活,就可能会继续进行分泌或通过自溶为机体提供G蛋白。外源蛋白在消化道环境中易形成乳糜微粒,这些微粒可通过淋巴管进入消化道具有丰富的粘膜毛细血管中,进而进入血液循环系统,被输送至包括血液在内的各个脏器,引起免疫反应,最终刺激机体产生中和性抗体。　　 为探索这一研究的可行性,我们首先通过生物信息学手段对实验用狂犬病病毒糖蛋白基因CVS24-G进行分析,确定了该蛋白的常规理化性质和基本结构:(1)CVS24糖蛋白分子大小约58.4kD,等电点为7.27。(2)该蛋白全长524aa,其中1～19aa为信号肽(Ss),28～458aa为膜外区域,459～478aa为跨膜区(TD),479～524aa为膜内区。(3)该蛋白去除信号肽后产生505aa的成熟蛋白,成熟蛋白上有四个糖基化位点,分别位于37aa,247aa,319 aa和480 aa。(4)通过CVS24-G与常用疫苗株3aG/PV/CTN的基因比对,发现CVS24-G基因与3aG/PV的G基因同源性达90％以上,与CTN株同源性达87％以上,糖基化位点与三种疫苗株基本一致。(5)结合蛋白质的柔性区间,抗原指数,表面可及指数和亲水性分析,预测CVS24-G蛋白可能的抗原表位区间为67～74,264～269,275～283,295～307,321～324,326～339,376～380,407～415。与目前已知的抗原位点相比,该蛋白的关键抗原表位位点330 aa,333 aa和339 aa位点在预测范围内。CVS24-G与其它三种疫苗株相比,除Ser(34)位为Arg(34)替代外,其余表位均表现一致。其中在决定毒株致病力的K330和R333位点上,CVS24-G与其它三种疫苗株一样,K(1ys)和R(Arg)分别由F(Phe)和A(Ala)替代,这两个位点的改变大大降低了它们的致病力,成为减毒株。由此可判断实验用狂犬病病毒糖蛋白基因可用于本课题的疫苗研究。因此,采用生物信息学手段分析预测基因结构功能和抗原表位位点,为疫苗的制备奠定基础。　　 实验第二阶段,构建了pYes-G(-SS)和pYes-InG(-SS-TD)两种重组载体。两种载体分别采用醋酸锂法转化酵母,Ura营养缺陷筛选阳性重组子,SDS-PAGE和Western blot分离鉴定目的蛋白等方法,研究了糖蛋白基因在酿酒酵母中的胞内表达和分泌表达。pYes-G(-SS)胞内表达研究结果显示,(1)去除信号肽的CVS24-G基因在酿酒酵母中表达的重组蛋白可能以两种形式存在,分别为yGI66kD和yG Ⅱ 58kD,而Western blot结果显示仅yG Ⅱ 58kD可与单克隆抗体结合,发生显色反应。结合其他研究结果,可以初步认为,在酿酒酵母中,CVS24-G蛋白TD区可能会影响yGI蛋白中抗原位点的暴露,从而影响它与单克隆抗体的结合。为验证这一判断,我们构建了去除TD区,但同时连接菊粉酶信号肽的融合基因InG,即pYes-InG(-SS-TD)重组载体,并研究了该融合基因在酿酒酵母中的分泌表达情况。首先,为增强结果的可比性,分别提取了pYes-G和pYes-InG重组酵母的胞内蛋白,SDS-PAGE分析比较发现,去除TD的CVS24-G基因在酿酒酵母中表达的重组蛋白大小与G(-SS)重组蛋白yG Ⅱ一致,从条带浓度判断,表达量略高于pYes-G重组酵母表达时yGⅡ的含量。上清液中分泌蛋白的Westernblot显示有特异性结合反应,大小约58kD,也与yG Ⅱ一致。这一结果表明TD区在蛋白质的成熟折叠过程中确实影响了糖蛋白的空间结构和大小。　　 基于重组微生物进入消化道后的治疗理论,我们将两组重组酵母pYes-G和pYes-InG分别灌胃小鼠,通过酵母存活率、免疫组化和血清ELISA等一系列指标检测验证口服重组活体酵母是否能刺激机体的免疫反应。　　 首先,取0.5ml OD600=10.8的任一种高密度重组酵母灌胃小鼠(n=12),分别于消化后8小时和12小时采集小鼠小肠组织,稀释小肠组织的提取液,铺于孟加拉红平板上粗略计算酵母存活率。最终结果显示,消化8小时后酵母存活率最高达36.11％,12小时后酵母最高存活率为0.59％,可以判断重组酵母能抵制消化道内的酸、盐和蛋白酶的破坏作用,在小肠大量定植并存活,这就为重组酵母释放生物活性物质提供了机会,而这一存活时间也是检测小鼠小肠中是否存在糖蛋白的最佳时机。　　 其次,两种重组酵母分别灌胃小鼠,灌胃时间为0d、7d、14d、21d、28d、35d和42d,并分别于28d,35d,42d灌胃结束次日采集小鼠血清和小肠组织。免疫组化结果显示,口服pYes-InG重组酵母的小鼠小肠组织中,能检测到抗原物质G蛋白的存在,说明pYes-InG重组酵母在消化道中可以继续进行分泌表达。相反,口服pYes-G重组酵母的小鼠小肠组织中,未能检测到该抗原物质,但并不能说明pYes-G重组酵母在消化道体内无法完成释放,其因为可能有两点,其一,pYes-G重组酵母的表达量很低,根据CVS24-G蛋白胞内表达结果,重组蛋白中仅yGⅡ能与抗体发生特异性反应,而这一蛋白仅占重组CVS24-G蛋白总量的1％,少量蛋白释放后又会被快速分解,因而导致难以检测；其二,尽管pYes-InG重组酵母的重组蛋白表达量略高于pYes-G重组酵母的yGⅡ蛋白,但因其是分泌表达,酵母可在消化道内持续分泌,直至细胞自溶破裂,因此及时的采集小肠组织样本,进行免疫组化反应,完全有可能检测到小肠组织中的狂犬病病毒糖蛋白。但这一外源物质能否被小肠M吞噬细胞识别,并进入淋巴细胞再循环过程刺激机体产生中和性抗体,还需通过ELISA检测小鼠体内的抗狂犬病的抗体滴度来判断。　　 第三,采集小鼠血液,进行ELISA。结果显示,口服pYes-InG分泌型重组酵母的小鼠血液中产生了一定滴度的中和性抗体,而口服pYes-G重组酵母的小鼠血液中没有产生中和性抗体,说明疫苗的免疫效果与外源活性物质的释放有密切关联；同时这一结果还表明,重组酵母在肠道分泌的蛋白颗粒可以被小肠M细胞吞噬,并由输出淋巴管进入淋巴再循环过程,从而引起机体的免疫应答,然后诱导机体产生抗体。这一结果确证了本实验构建的分泌型重组酵母可以作为狂犬病疫苗,对狂犬病起到一定的预防作用。　　 另外,ELISA结果还提示,经过5～6次的小鼠免疫接种后,小鼠体内产生的抗体基本恒定或呈缓慢增加趋势,说明口服重组酵母疫苗仍为一种多剂量疫苗,需多次接种才有效果,而且抗体产生需要一定的时间,因此这类疫苗不适合对突发性狂犬病传染进行控制或对狂犬病患者进行治疗。　　 总之,经过上述实验环节,我们成功构建了狂犬病口服疫苗,其安全性和免疫有效性均得到了初步验证。尽管口服重组酵母疫苗在治疗效果上存在缺陷,但因其具有接种方便安全,易于大规模生产(传统的好氧高密度发酵即可满足生产),并且产物是酵母细胞,产品的分离纯化容易,保存简单,保存期长,易于运输管理等优点,可以弥补多剂量服用,抗体产生迟缓等不足,适合对人或动物进行预防；而且由于成本低廉,尤其适应市场需求,可作为全球传统狂犬病疫苗的补充形式被接受和应用。