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研究背景失重导致的心血管功能失调是长期航天飞行中航天员面临的健康问题之一,其主要表现为立位耐力降低和运动能力下降,严重者可出现晕厥,严重危害航天员的健康,而目前对抗心血管功能失调的措施极其有限,因此,深入研究其发生机理对发展有效的防护措施意义重大。血管内皮细胞作为血管的内层衬里,通过自分泌、旁分泌、血管生成、白细胞粘附、调节血管壁通透性和调节血管平滑肌收缩等途径在血管功能中发挥重要的调节作用。自噬是细胞为了保持自身稳态对于外界环境变化做出的应激性反应。大量研究表明,血管内皮细胞的自噬与多种心血管功能紊乱和疾病有密切的关系。近年来,本课题组研究发现模拟失重后,在细胞和整体水平血管内皮细胞自噬水平均有增强,因此我们推测自噬激活可能在失重致血管功能失调中发挥重要作用,深入探讨其作用机制对于明确其作用靶点具有重要的价值。目的本课题拟在前期研究基础上,探讨自噬与失重后血管内皮细胞功能改变的关系,从细胞和分子水平阐明失重诱导血管内皮细胞自噬的调控机制。方法1.体外培养HUVECs,随机分为回转模拟失重24h(24hMG)、48h(48hMG)和72h(72hMG)组以及地面正常重力对照24h(24hCon)、48h(48hCon)和72h(72hCon)组,Western blot检测自噬标志性分子LC3和p62的时程变化;免疫荧光检测HUVECs和PMVECs在回转48h后的LC3斑点聚集情况,透射电子显微镜分别检测回转48h后HUVECs和PMVECs中的自噬体和自噬溶酶体。2.将3-MA作为自噬的特异性阻断剂,将HUVECs分为地面正常重力对照组(Con)、地面正常重力对照+3-MA组(Con+3-MA)、回转模拟失重组(MG)、回转模拟失重+3-MA组(MG+3-MA),回转模拟失重48h后Western blot检测HUVECs中LC3II与LC3I的比值以及p62蛋白的表达量,检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及活化的caspase3的表达,AnnexinV-FITC/PI双染色后经流式细胞仪测定凋亡率,Transwell侵袭小室实验和划痕实验检测细胞的迁移能力。3.在HUVECs回转模拟失重48h后,Western blot检测LC3、p62、p53、磷酸化AMPK和反映mTOR活性的磷酸化p70S6K的蛋白表达变化;在地面正常重力下敲低HUVECs中p53的表达以及回转模拟失重下过表达p53,而后检测HUVECs中自噬相关分子LC3、p62和磷酸化p70S6K的蛋白表达变化,免疫荧光显微镜测定各组细胞中LC3的斑点聚集情况。4.回转模拟失重48h后,Western blot检测HUVECs胞质胞核中p53的表达变化,实时荧光定量PCR检测HUVECs中p53 mRNA的变化;在沉默HDM2及应用蛋白酶体抑制剂MG132两种条件下分别检测回转模拟失重48h后HUVECs中LC3、p53、p62和磷酸化p70S6K的表达,免疫荧光检测HUVECs中LC3斑点聚集情况;免疫共沉淀检测HUVECs回转模拟失重48h后HDM2与p53之间的结合;回转模拟失重同时加入出核转运抑制剂LMB,检测HUVECs胞质和胞核中p53变化及LC3、p62和磷酸化p70S6K的表达,免疫荧光检测LC3斑点聚集情况。结果1.回转24h、48h和72h后,HUVECs中LC3II与LC3I的比值均升高,p62均降低。回转48h后,HUVECs和PMVECs含LC3斑点(>5个)的细胞数目较对照组显著增多,透射电子显微镜观察到回转48h后HUVECs和PMVECs中自噬体和自噬溶酶体产生。2.3-MA能有效逆转模拟失重引起的HUVECs LC3II/LC3I比值升高及p62表达降低;与单纯模拟失重组相比,模拟失重同时用3-MA阻断自噬后,HUVECs细胞凋亡率升高,凋亡相关蛋白Bcl-2表达降低,Bax表达升高,活化的caspase3表达升高,Transwell实验中细胞迁移率降低,划痕愈合率下降。3.与地面正常重力对照组相比,回转模拟失重48h后HUVECs LC3II/LC3I比值升高,p62和磷酸化p70S6K的表达均显著降低,磷酸化AMPK变化不明显;在正常重力条件下沉默p53会使HUVECs LC3II/LC3I比值升高,p62表达减少,p70S6K磷酸化减少,免疫荧光显示LC3呈斑点状聚集的细胞比例增高,而在模拟失重条件下过表达p53会逆转失重引起的HUVECs的自噬增强。4.回转模拟失重48h后,HUVECs中p53的mRNA水平变化不明显,而胞质和胞核中p53蛋白水平均显著降低;沉默HDM2或者加入MG132均可逆转模拟失重导致的HUVECs p53蛋白表达量减少、LC3II/LC3I比值升高、p62及磷酸化p70S6K降低、LC3呈斑点状聚集的细胞比例升高等变化;免疫共沉淀显示回转48h后HUVECs HDM2与p53结合增强;模拟失重同时加入出核转运抑制剂LMB后,HUVECs胞质p53相较于对照组变少,而胞核p53与对照组相比无明显变化,LC3II/LC3I比值升高,p62表达减少,p70S6K磷酸化减少,免疫荧光显示LC3呈斑点状聚集的细胞比例增高。结论1.回转模拟失重可使HUVECs和PMVECs自噬增强。2.自噬能部分抑制回转模拟失重48h引起的HUVECs凋亡增高,并增强HUVECs的细胞迁移能力。3.HUVECs在回转模拟失重48h后p53表达下降进而使mTOR活性降低,并最终诱导自噬增强,这一过程不依赖于AMPK的活性改变。4.回转模拟失重48h促进HUVECs中的p53与HDM2结合,随后胞质p53在26S蛋白酶体被降解,从而降低mTOR活性,使自噬水平升高。综上所述,我们发现回转模拟失重可引起大血管内皮细胞和微血管内皮细胞出现自噬增强,这种自噬的增强可部分抑制模拟失重诱导HUVECs的凋亡,促进内皮细胞迁移。进一步研究发现,自噬增强的机制为回转模拟失重可促进HUVECs胞质中p53与HDM2的结合,进而介导了p53在蛋白酶体被降解,从而降低了HUVECs中mTOR活性,最终使自噬水平升高。本研究为深入探讨失重致心血管功能失调的分子机制提供了思路,为开发失重条件下心血管保护措施提供了理论依据。