【研究背景】　　子痫前期是妊娠特异性的综合征，通常在妊娠20周后发病，可引起全身多器官系统的损害，表现为高血压、蛋白尿、水肿和胎儿生长受限等。子痫是继发于子痫前期。不能用其它原因解释的抽搐，可发生于分娩前、分娩中和分娩后。国外报道约10％-25%的子痫抽搐发生于产后48小时，在初产妇中尤其明显。　　子痫/子痫前期是严重威胁母儿健康造成孕产妇及围产儿发病及死亡的主要原因之一，子痫前期和子痫每年导致约65000孕产妇死亡，占到所有孕产妇死亡比例的12%。子痫前期/子痫又是导致早产，引起新生儿不良结局的重要原因，据统计15%的早产由子痫前期导致。终止妊娠通常是重度子痫前期/子痫的唯一有效治疗方法。　　目前，子痫前期病因学研究的主要观点包括滋养细胞侵袭不良导致的胎盘浅着床、免疫不耐受、血管内皮功能紊乱、易感基因遗传因素、氧化应激等，但尚无定论。关于子痫的研究报道相对较少，部分观点认为脑血管收缩痉挛、脑水肿、类似高血压脑病等在子痫发病中发挥重要作用，但具体触发机制都尚待证实。目前尚无子痫动物模型建立的相关研究报道，建立可以模拟其发病特征的动物模型，对于研究其发病机制及探寻有效的预防治疗方法将具有重要意义。　　第一部分子痫前期动物模型的建立　　【目的】　　为了更好的研究子痫前期/子痫并为下一步探讨建立类子痫模型奠定基础，拟先建立子痫前期大鼠模型，建造方法参照Faas等利用极低量内毒静脉注射妊娠大鼠的方案，同时用该疾病相关临床指标及血管因子sFlt-1和PlGF的表达水平来评估该模型。　　【材料与方法】　　1、实验动物及分组：实验动物：购买SPF级3月龄的SD雌性大鼠（约200g），适应性喂养　　一周后按雌雄2:1进行合笼，阴道涂片发现精子定义为妊娠第0天；实验分组：　　2、给药方法：按照Faas等人的方法利用极微剂量内毒素（lug/kg体重）复制子痫前期大鼠模型，于大鼠妊娠第14天，静脉缓慢泵入内毒素lug/kg(生理盐水溶解配制稀释为2m1)，建立子痫前期大鼠模型；对照组给予等量生理盐水注射。　　3、血压和尿蛋白监测：于妊娠第5、7、11、13、17、19天8:00-12:00am分别测血压；于妊娠第7、12、16、19天收集检测24小时尿蛋白；非孕鼠的血压测量和尿蛋白检测时间点按同批次孕鼠的妊娠时间进行处理；对结果进行统计分析；　　4、临床相关生化指标监测：于妊娠第20天麻醉大鼠，取静脉血收集血清后全自动生化分析仪分别检测谷丙氨酸转氨酶（ALT）、谷草氨酸转氨酶（AST）、血肌酐（CCr）和尿素氮（BUN）的水平，并进行统计分析；　　5、血管因子sFlt-1和PlGF检测：ELISA技术检测血管相关因子sFlt-1、PlGF的血清表达水平并进行比较分析；　　6、围产结局：剖宫取胎对胎鼠进行称重计数，记录可见的吸收胎个数，并称量胎盘的重量，对结果进行统计分析；　　7、统计学分析：采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理，正态分布计量资料用均数±标准差(x?±s)表示，计数资料用百分数表示，单因素方差分析(One-way for ANOVA)用于分析血压、尿蛋白及各生化指标；多组数据两两比较用Bonferroni法，非参数检验用Kruskale-Wallis检验法； P<0.05表示差异有统计学意义。　　【结果】　　1、平均动脉收缩压（ SBP）：妊娠第13天四组大鼠基础血压无差异（113±4vs112±4vs111±6vs109±4，P=0.174）；妊娠第15天，PE模型组血压升高；妊娠第17天PE模型组血压明显高于正常妊娠组、非孕内毒素组和非孕生理盐水组，差异均具有显著性（129±5vs113±4,110±5,111±4，P<0.05）；妊娠第19天PE模型组血压继续升高，和正常妊娠组、非孕内毒素组、非孕生理盐水组相比，差异均具有显著性（135±7vs116±3,112±4,110±4，P<0.05）；　　2、24小时尿蛋白：妊娠第7天，第12天四组大鼠24小时尿蛋白均无统计学差异，妊娠第16天PE模型组24小时尿蛋白明显升高（3.1±0.3），和正常妊娠组（2.6±0.4）、非孕内毒素组（2.4±0.6）、非孕生理盐水组（2.5±0.4）相比差异均具有统计学意义（P<0.05）；妊娠第19天PE模型组24小时尿蛋白明显高于正常妊娠组、非孕内毒素组和非孕生理盐水组，差异均具有统计学意义（3.8±0.5vs2.6±0.6,2.4±0.4,2.3±0.4，P<0.05）；　　3、血清AST: PE模型组血清AST水平（291±179）明显高于正常妊娠组（131±25）、非孕内毒素组（121±28）和非孕生理盐水组（117±17），具有显著性差异（p=0.02）；正常妊娠组，非孕内毒素组和非孕生理盐水组三组间相比无统计学差异（p=0.09）；　　4、血清BUN：PE模型鼠血清BUN水平明显高于正常妊娠组、非孕内毒素组和非孕生理盐水组，差异具有统计学意义（7,5±1.0vs6.5±0.8,6.2±0.9,6.1±0.9，P=0.04）；正常妊娠组、非孕内毒素组和非孕生理盐水三组相比无明显差异（P=0.18）；　　5、妊娠结局：PE模型组活胎重量小于正常妊娠组（4.77±0.11 vs4.01±0.16，P<0.01）；PE模型组胎盘重量小于正常妊娠组（0.52±0.05vs0.60±0.02，P<0.05）；PE模型组可见吸收胎鼠数大于正常妊娠组（P<0.05）；　　6、血管因子sFlt-1和PlGF的表达水平：PE模型组血清sFlt-1水平（162.7±73.9 pg/ml）明显高于正常妊娠组(123±64 pg/ml)，差异具有统计学意义(P=0.04)；PE模型组血清PlGF水平(9.7±6.2 pg/ml)显著低于正常妊娠组(23.4±12.4)(P=0.03)；PE模型组sFlt-1/PIGF比值显著高于正常妊娠组（18.3±5.6 vs6.7±2.1，P=0.02)；　　【结论】　　1.于大鼠妊娠第14天单次极低剂量内毒素尾静脉缓慢注射使孕鼠血压升高、尿蛋白增加、肝肾生化指标升高及胎盘和仔鼠重量降低，很好的模拟了临床子痫前期疾病特征；　　2.实验中，PE模型鼠sFlt-1表达升高，PlGF表达下降和最新临床证据相一致，可认为子痫前期建模符合临床疾病特征。　　第二部分电刺激法建立类子痫抽搐动物模型　　【目的】　　在子痫前期动物模型基础上，通过电刺激的方法建立一个能够模拟临床子痫发病特征的动物模型，对于研究其病理机制及探寻新的有效治疗手段具有重要的意义。　　【材料与方法】　　1、实验动物及分组：　　实验动物：具体情况如第一部分所述。　　实验分组：　　1)子痫模型组（7只）接受内毒素注射及电刺激诱发抽搐；　　2) PE模型组（6只）接受内毒素注射不接受电刺激；　　3)正常妊娠抽搐组（6只）接受生理盐水注射和电刺激诱发抽搐；　　4)正常妊娠对照组（6只）只接受生理盐水注射；　　5)非孕抽搐组(12只)接受生理盐水注射及电刺激诱发抽搐；　　6)非孕对照组（12只）只接受生理盐水注射。　　2、电极植入：适应性喂养一周后脑立体定位仪固定、定位进行手术给予海马区预置双极电极，手术后休息一周按雌雄2:1进行合笼，阴道涂片发现精子定义为妊娠第0天。　　3、PE模型鼠制作处理如第一部分所述；　　4、电刺激：子痫模型抽搐组、正常妊娠抽搐组和非孕抽搐组均在大鼠妊娠第18天给予电刺激诱发抽搐，观察大鼠抽搐生物学行为，刺激参数为电流0.2mA、频率20Hz、间隔100ms、波宽1ms，观察各组抽搐情况；　　5、抽搐生物学行为观察：子痫抽搐生物学行为分级参照Racine等经典分级：无任何癫痫发作行为记0分；凝视发作记1分；出现规律性点头或湿狗样抖动(WDS)，伴有或不伴有面部抽动记2分；出现一侧前肢震颤记3分；站立、双前肢震颤及持续性点头记4分；双前肢震颤加重，失去平衡跌倒而出现全身性强直一阵挛性发作记5分。在30分钟内发生4到5级抽搐视为诱发成功，30分钟内无法诱发抽搐行为发生的记录相应生物学评分。每组大鼠接受30分钟刺激，刺激时间内发生4-5级抽搐视为点燃；超过30分钟未发生4-5级抽搐视为点燃失败，记录并统计分析每组大鼠诱发抽搐所需要的刺激时间，点燃失败按30分钟计。　　6、EEG记录：深部脑电图（EEG）记录大鼠子痫或者抽搐发作前后脑电变化；　　7、炎性因子TNF-α和IL-1β检测：ELISA技术检测炎性因子TNF-α和IL-1β血清表达水平，并进行比较；　　8、统计学分析：采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理，正态分布计量资料用均数±标准差(x?±s)表示，计数资料用百分数表示，单因素方差分析用于诱发抽搐时间的统计；非参数检验用Kruskale-Wallis检验法；P<0.05表示差异有统计学意义。　　【结果】　　1、电极植入情况：共有80只SD雌性大鼠接受电极植入，死亡或电极脱落共17只，电极植入成功率为79%；　　2、抽搐生物学行为：　　1)各组大鼠诱发抽搐时生物学行为符合Racine等描述的经典癫痫发作行为：开始刺激后各组大鼠出现须动，烦躁，然后凝视、不动，呈阵发性，此后开始表现为湿狗样运动，或出现自动症，如重复、刻板地点头、咀嚼、哈欠、流涎等，伴有嘴角面部抽动，以及轻度惊厥，出现一侧前肢震颤；站立、双前肢震颤及持续性点头；双前肢震颤加重，失去平衡跌倒而出现全身性强直一阵挛性发作；　　2)正常妊娠组（6/6）和子痫模型组(7/7)大鼠抽搐点燃率均为100%，明显高于非孕抽搐鼠（5/12）42%；　　3) EEG结果显示各组大鼠诱发抽搐后有痫样波，如棘波、尖波、棘一慢复合波等　　4)子痫模型组诱发抽搐的时间（3.3±1.4min）明显短于正常非孕抽搐组(10.6±7.1min)，P=0.00；　　5)子痫模型组诱发抽搐的时间（3.3±1.4min）和正常妊娠鼠诱发抽搐的时间（4.8±2.2min）相比减少了31.25%，P=0.17；　　3、炎性因子TNF-α和IL-1β的表达水平：　　1) PE模型组中IL-1β的血清水平明显高于正常妊娠组和非孕组，三组之间差异具有统计学意义，（82.56±36.19vs57.91±20.21,40.92±15.64，p=0.02.）　　2)组间两两比较，PE模型组IL-1β的血清水平高于正常妊娠组，但差异无统计学意义（82.56±36.19vs57.91±20.21，P=0.176）；正常妊娠组血清IL-1β的表达水平相比非孕鼠也有明显升高，但没有统计学意义（57.91±20.21vs40.92±15.64，p=0.24.）。　　3) PE模型组中TNF-α的血清水平相比正常妊娠鼠有升高表现，但差异尚无统计学意义（14.36±4.7vs11.99±2.8，P=0.31）,非孕组中血清中TNF-α的表达水平低于试剂盒检测下限，未能得到相关检测数据。　　【结论】　　1.生物学行为和 EEG记录说明电刺激子痫前期模型鼠诱发抽搐在一定程度上模拟了子痫发病的临床特征。　　2.子痫前期模型鼠和正常孕鼠及非孕鼠相比电刺激诱发抽搐阈值是降低的。　　3.子痫前期模型鼠电刺激诱发抽搐阈值的降低可能与炎症反应的严重程度有关。　　第三部分硫酸镁对类子痫抽搐模型鼠的防治作用　　【目的】　　子痫是妊娠期非常危险的并发症，是世界范围内导致孕产妇死亡的主要原因。硫酸镁是临床上用于防治子痫最为常用的药物，然而对于其作用机制及安全性尚有争议。本研究旨在研究静脉注射硫酸镁在子痫/子痫前期动物模型中的防治作用及特点。　　【材料与方法】　　1、实验动物及分组　　实验动物：具体条件如第一部分所述。　　实验分组：妊娠第14日，将妊娠大鼠随机分为3组　　1)正常妊娠对照组（6只）接受持续性生理盐水泵入；　　2) PE模型对照组（7）接受持续性生理盐水泵入；　　3) PE模型治疗组（8只）接受持续性硫酸镁泵入（60mg/kg/day）。　　2、电极植入：电极植入方法同第二部分所述。　　3、子痫前期模型建立处理：子痫前期模型建立处理及监测指标如第一部分；　　4、微型胶囊渗透泵植入：妊娠第14日，三组大鼠均植入ALZET微型胶囊渗透泵，正常妊娠组持续泵入生理盐水，子痫前期对照组持续泵入生理盐水，子痫前期治疗组持续泵入硫酸镁（60mg/kg/day）。　　5、镁离子浓度检测：妊娠第7日、第16日、第19日眼眶取血，静置离心后取血清全自动生化分析仪检测镁离子浓度；　　6、电刺激及生物学行为观察：妊娠第18天，电刺激三组孕鼠，刺激参数为电流0.2mA、频率20Hz、间隔100ms、波宽1ms，观察各组大鼠生物学行为；记录分析各组大鼠30分钟内的抽搐发生率，各组大鼠诱发4级以上抽搐所需要的诱发时间及各组大鼠抽搐持续时间，进行统计分析；　　7、EEG记录：EEG记录各组大鼠抽搐前后脑电活动变化。　　8、统计学分析：采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理，正态分布计量资料用均数±标准差(x?±s)表示，计数资料用百分数表示，单因素方差分析用于诱发抽搐时间和脑电图波幅的统计；非参数检验用 Kruskale-Wallis检验法；P<0.05表示差异有统计学意义。　　【结果】　　1、镁离子血清浓度：子痫前期治疗组镁离子的血清浓度为0.86±0.24mmol/L，明显高于PE模型对照组(0.61±0.12mmol/L)和正常妊娠组(0.63±0.09mmol/L)，差异均具有统计学意义（P<0.05）；　　2、抽搐生物学行为：　　1) PE模型治疗组30分钟内的抽搐发生率为62.5%，和PE模型对照组（100%）及正常妊娠组（100%）相比减少了37.5%的点燃发生率，但差异无统计学意义（P>0.05）；　　2) PE模型治疗组诱发抽搐的时间(21.7±8.9min）明显高于 PE模型对照组(3.3±1.4min)和正常妊娠组（4.8±2.2min），差异均具有显著性差异（P<0.05）；　　3) PE模型治疗组抽搐持续时间(13±4s)明显短于PE模型对照组(21±9s)及正常妊娠组(18±7s)，差异均具有显著性差异（P<0.05）；　　3、EEG：PE模型组和正常妊娠组大鼠抽搐后都伴随痫样放电波；PE模型治疗组抽搐时 EEG检测平均波幅(58±6μv)明显低于正常妊娠组(171±32μv)及 PE模型对照组(162±39μv)，差异均具有显著性差异（P<0.05）；　　【结论】　　1.硫酸镁能够显著延长子痫前期模型鼠电刺激诱发抽搐所需要的时间；　　2.硫酸镁预防能够减少类子痫模型鼠电刺激诱发抽搐的持续时间；　　3. EEG结果提示硫酸镁对子痫前期模型鼠诱发类子痫抽搐的防治作用可能具有中枢性的作用。