论文部分内容阅读
纳米纤维能够有效模仿细胞外基质,提供适合的接触引导来帮助神经细胞分化和神经突触生长,因此成为神经组织工程常用的生物材料。为在神经组织工程中进一步应用定向纳米纤维,设计新的纳米纤维材料表面,全面深入地阐释定向纳米纤维影响神经细胞分化的分子机理,需要了解这个过程中所有基因、mRNA、蛋白质、代谢物的差异表达以及组分相互间的关系。近年出现的高通量技术和系统生物学方法为从RNA、蛋白质、代谢物等层次,全面系统地了解生物材料对细胞的影响和深入研究分子机理提供了强有力的技术方法支持。本论文的目的是综合运用代谢组学技术和生物信息学方法,研究左旋聚乳酸定向/不定向纳米纤维对PC12细胞内代谢物表达的影响,在代谢层次揭示旋聚乳酸定向/不定向纳米纤维对PC12细胞的影响。随后与本课题组前期的研究结果(转录组学和蛋白质组学)进行联合分析,从系统生物学的角度阐释PLLA定向纳米纤维影响PC12细胞分化的机理。本论文的具体工作如下:1、采用静电纺丝法制备左旋聚乳酸(PLLA)定向/不定向纳米纤维,采用匀胶法制备PLLA薄膜。对三种材料进行了扫描电子显微镜(SEM)观察。结果表明,PLLA薄膜表面比较平滑,PLLA定向/不定向纳米纤维粗细均一且无串珠,纤维直径分别为279.58±6.67 nm和245.02±7.93nm,定向纳米纤维具有较好的取向性;2、将预分化48h的PC12细胞分别种植在PLLA定向纳米纤维(实验组1,简称AF组)、PLLA不定向纳米纤维(实验组2,简称RF组)和PLLA薄膜(对照组,简称C组)上12h、24h和36h,搜集细胞样本用于代谢组学实验,一共六个实验组(AF组的三个间分别简称为A12、A24和A36,RF组的分别简称为R12、R24和R36),三个对照组(分别简称为C12、C24和C36),每组106~107个细胞样本(n=5);3、采用基于液相色谱质谱联用的代谢组学研究手段,分别分析了PC12细胞种植在左旋聚乳酸的三种表面(定向纳米纤维表面、不定向纳米纤维表面和薄膜表面)12h、24h和36h后,细胞内代谢物的表达进行相对定性分析,得到六个实验组和三个对照组的代谢物表达谱峰图。使用主成分分析法和最小二乘判别分析法结合t检验,筛选得到相对于对照组差异表达的代谢物,相对于C12组,A12组和R12组差异表达的代谢物数目分别为53种和54种,相对于C24组,A24组和R24组差异表达的代谢物数目分别为50种和47种,相对于C36组,A36组和R36组差异表达的代谢物数目分别为32种和42种;4、采用生物信息学方法对差异表达代谢物进行了聚类分析和MetPA分析,发现在PLLA定向和不定向纳米纤维这两种表面上培养了12h的细胞内代谢物表达情况与培养了24h和36h的细胞内代谢物表达情况差别较大,对AF组和RF组三个时间点均差异表达的代谢物进行通路分析,得到的通路中,AF组与RF组共有的通路苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成,苯丙氨酸代谢,组氨酸代谢以及AF组有而RF组没有的花生四烯酸代谢和牛磺酸,亚牛磺酸代谢通路与神经细胞的分化相关;5、对所得的代谢组学实验数据和课题组前期得到的转录组学和蛋白质组学实验数据进行联合分析,得到种植在PLLA定向纳米纤维表面的PC12细胞内基因、蛋白质和代谢物的差异表达引起的通路有11条,而PLLA不定向纳米纤维表面的PC12细胞内基因、蛋白质和代谢物的差异表达引起的通路有7条。在这些通路中,AF组与RF组共有的通路酪氨酸通路和AF组有而RF组没有的鞘脂类代谢和甘油磷脂代谢通路与分化相关,从氨基酸代谢和脂质代谢两个部分对PLLA影响PC12细胞的分化机理进行讨论发现,基因Lao1的下调表达导致了苯丙氨酸的下调表达,加之与酪氨酸分解相关的蛋白质Gstz1上调表达,导致酪氨酸下调表达。基因Aoc3上调表达与基因Aldh3a1下调表达的共同作用下,多巴胺上调表达。基因Aldh3a1的下调表达导致去甲变肾上腺素的上调表达。基因Pla2g4b上调表达导致磷脂酶的上调表达,促进了溶血磷脂和花生四烯酸的释放,因此能够分泌更多神经递质。因此PLLA定向纳米纤维表面的PC12细胞内部,不利于神经细胞分化的苯丙氨酸及其代谢物下调表达,有利于神经细胞分化的花生四烯酸、多巴胺等上调表达,充分说明PLLA定向纳米纤维有利于PC12细胞的分化。