论文部分内容阅读
柿（Diospyros kaki,L.）果实,一般按照能否在树体上进行自然脱涩可以分为甜柿和涩柿两大类。甜柿果实在树体上可以完全地完成自然脱涩过程,从而脱去涩味;而涩柿的果实不能在树体上完成自然脱涩,所以它们在成熟时仍含有大量的可溶性单宁,使人们食用的时候感受到涩味,所以涩柿果实在采后必须经过人工脱涩处理之后才能供人食用。并且不同品种的柿果实在进行脱涩处理时会表现出不同的脱涩效率,但由于不同温度、不同处理、不同季节等原因,导致结果间的差异很难比较,且相应的机制也较不明晰。本研究关注了产业中最为常用的高浓度CO2处理,以42个不同品种的成熟涩柿果实作为实验材料,通过高浓度CO2处理（95%CO2+1%O2）进行采后脱涩,通过单宁印迹、单宁含量测定等判定脱涩难易、利用RNA-seq结合WGCNA相关性分析等筛选出差异基因,并对其进行初步验证。主要结果如下:1.42个不同品种的成熟涩柿果实的生理指标表现出较明显的品种间差异。本实验使用的成熟涩柿果实于2017年10月采自陕西种质资源圃。对未经处理的新鲜柿果实进行硬度和色差测定,硬度最低的是‘早盖柿（ZGS）’,硬度低于值20 N;硬度最高的是‘耀县五花柿（YXWHS）’,硬度值高于70 N,不同品种柿果实硬度存在较大差异可能与成熟度、果肉质地等有关。不同品种果实色差的L值在5070之间,差异不明显,说明不同品种柿果实表面光泽度差别不大;a值在1035之间,b值在4065之间,说明不同品种柿果实的果皮颜色之间存在品种间差异,但在同一品种的果实之间则差异不大。2.高浓度CO2处理后,42个不同品种的成熟涩柿果实表现出不同的脱涩效果。鲜样果实的单宁印迹分析初步揭示了高浓度CO2处理下不同品种果实的脱涩难易。进一步分析了可溶性单宁和不可溶性单宁的含量,发现42个不同品种果实初始点的可溶性单宁含量分布在0.44%1.39%之间,而不可溶性单宁含量范围在0.01%0.18%之间;高浓度CO2处理24 h后果实可溶性单宁和不可溶性单宁含量分别分布在0.003%1.1%和0.08%1.01%之间。综合单宁印迹、含量及脱涩率比较,将不同品种分为三大类,其中较难脱涩的定义为难脱涩品种（高浓度CO2处理24 h后可溶性单宁含量>0.6%,脱涩率低于40%）,而较容易脱涩的定义为易脱涩品种（高浓度CO2处理24 h后可溶性单宁含量<0.2%,脱涩率高于70%）。由于不同品种果实初始可溶性单宁含量略有差异,比较单一品种果实的脱涩率,最高的品种为‘阳朔牛心柿（YSNXS）’、‘三原烧柿（SYSS）’、‘么心柿（MXS）’、‘长安火罐柿（CAHGS）’、‘益都托柿（YDTS）’等,相反脱色率最低的品种分别是‘洛阳长天生柿（LYCTSS）’、‘黎城绵柿（LCMS）’、‘小蒂柿（XDS）’、‘老皮革（LPG）’。3.基于转录组测序和WGCNA相关性分析分析,初步筛选出可能与品种间脱涩难易差异相关的20个差异表达基因。选择‘四沟柿（SGS）’和‘洛阳方天生柿（LYFTSS）’为易脱涩品种的代表,选择‘老皮革（LPG）’和‘小蒂柿（XDS）’为难脱涩品种的代表,进行转录组测序,得到基因拼接序列、基因在测序品种中不同的表达量、GO、COG、KEGG功能预测等多方面的信息,并将转录组中基因序列与柿基因组序列进行比对确认。进一步结合生理数据进行WGCNA相关性分析,初步筛选出28个差异表达基因,经过qPCR验证确定20个差异表达基因。4.前期研究表明高浓度CO2处理在多个柿品种中具有加速脱涩并诱导软化现象,为进一步排除软化相关的基因,利用CO2+1-MCP处理的‘镜面柿’样品（脱涩保脆）进行验证,最终得到可能与导致品种间脱涩难易差异相关的14个差异基因,分别为EVM0027048（多聚泛素蛋白）,EVM0027265（甲基腺嘌呤-DNA糖基化酶）,EVM0028686（薄荷醇脱氢酶）,EVM0031224（赖氨酸特异性脱甲基酶）,EVM0002193（脱镁叶绿素酶）,EVM0009991（扩张蛋白）,EVM0015029（功能未知）,EVM0026845（功能未知）,EVM0031877（FRK,果糖激酶-6）,EVM0002369（谷胱甘肽S-转移酶）,EVM0017291（12-氧代二亚油酸还原酶）,EVM0021701（功能未知）,EVM0023725（UDP-糖基转移酶）,EVM0029962（羧酸酯酶）。在这14个差异基因中,有泛素化、甲基化相关的基因,可能参与醇醛转换或单宁聚合;果糖激酶相关的基因可能在调控网络的上游起作用。尤其值得关注的是谷胱甘肽S-转移酶和UDP-糖基转移酶等相关基因,推测其可能作用于单宁单体的糖基化过程和单宁的转运与转化过程,UDP-糖基转移酶可能通过与没食子酸结合,使没食子酸进行糖基化,参与单宁的转化过程,将原来的可溶性单宁转化为不可溶性单宁,然后经过谷胱甘肽S-转移酶的作用,将不可溶性单宁转运至液泡中以单宁细胞的形式储存起来,从而实现脱涩的目的。综上所述,本研究比较分析了高浓度CO2处理对42个涩柿品种果实的脱涩效应比较,筛选并初步验证了与不同品种涩柿脱涩难易相关的差异表达基因,这些结果为探究不同品种之间脱涩难易原因提供初步数据基础。